מתוך בונה קריסטלים - לקראת מבנה קביעת β-חבית החיצון ממברנה חלבונים
Summary
β-barrel outer membrane proteins (OMPs) serve many functions within the outer membranes of Gram-negative bacteria, mitochondria, and chloroplasts. Here, we hope to alleviate a known bottleneck in structural studies by presenting protocols for the production of β-barrel OMPs in sufficient quantities for structure determination by X-ray crystallography or NMR spectroscopy.
Abstract
Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% percent of known structures. There are two types of membrane proteins, α-helical and β-barrel. While α-helical membrane proteins can be found in nearly all cellular membranes, β-barrel membrane proteins can only be found in the outer membranes of mitochondria, chloroplasts, and Gram-negative bacteria. One common bottleneck in structural studies of membrane proteins in general is getting enough pure sample for analysis. In hopes of assisting those interested in solving the structure of their favorite β-barrel outer membrane protein (OMP), general protocols are presented for the production of target β-barrel OMPs at levels useful for structure determination by either X-ray crystallography and/or NMR spectroscopy. Here, we outline construct design for both native expression and for expression into inclusion bodies, purification using an affinity tag, and crystallization using detergent screening, bicelle, and lipidic cubic phase techniques. These protocols have been tested and found to work for most OMPs from Gram-negative bacteria; however, there are some targets, particularly for mitochondria and chloroplasts that may require other methods for expression and purification. As such, the methods here should be applicable for most projects that involve OMPs from Gram-negative bacteria, yet the expression levels and amount of purified sample will vary depending on the target OMP.
Introduction
β-חבית OMPs ניתן למצוא רק את הקרומים החיצוניים של המיטוכונדריה, כלורופלסטים, וחיידקים גראם שליליים 1-3. בעוד הם משמשים תפקידים דומים כמו חלבוני הסליל α, יש להם קפל שונה מאוד מורכב תחום β-חבית קרום מוטבעת מרכזי החל 8-26 אנטי במקביל β-גדילים עם כל גדיל להיות מחובר בטבורו שני גדילים שהכנות (איורים 1 ו -2). הגדילים הראשונים והאחרונים של תחום β-החבית אז אינטראקציה זה עם זה, כמעט באופן בלעדי בצורה אנטי-מקבילה (למעט VDAC המיטוכונדריה), כדי לסגור ולאטום את תחום β-החבית מן הקרום שמסביב. כל β-חבית OMPs לולאות תאיות של רצף משתנה ואורך אשר ממלאות תפקיד חשוב באינטראקציות ליגנד ו / או אנשי קשר חלבונים, עם הלולאות אלה לפעמים להיות גדולות כמו 75 שאריות, כגון נמצא transferrin Neisserial מחייב פרוהחלבון A (TbpA) 4. β-חבית OMPs יכול גם יש N-terminal או C- מסוף רחבות periplasmic המשמשים תחומים נוספים כמו לצורך הפעילות של החלבון (למשל, במה 5-7, FimD 8,9, פאדל 10). בעוד סוגים רבים של OMPs β-חבית קיימים 11, שני הסוגים הנפוצים יותר מתוארים להלן כדוגמאות עבור אלה פחות שמכיר את השטח, (1) מובילי תלויי TonB ו (2) autotransporters.
TonB תלוי מובילים (למשל, FepA, TbpA, BtuB, Cir, וכו ') הם חיוניים עבור יבוא מזין ומכילים תחום תקע N-terminal מורכב ~ 150 שאריות כי הוא נמצא תחוב בתוך בטרמינל C-22 גדילי β- תחום החבית מוטבע לתוך הקרום החיצוני 12 (איור 3). בעוד תחום תוסף זה מונע מצע מלעבור בחופשיות דרך התחום לחבית, מצע מחייב גורם לשינוי קונפורמציה בתוך תחום התקע הב מוביל היווצרות נקבובית (בין אם על ידי סידור מחדש את רדיו או על ידי פליטה חלקית / מלאה של התקע) אז מה שיכול להקל תחבורת מצע דרך הממברנה החיצונית לתוך periplasm. מובילי TonB התלוי חשובים במיוחד להישרדותו של כמה זנים פתוגניים של חיידקים גראם שליליים כגון meningitidis Neisseria שהתפתח מובילים מיוחדים לחטוף חומרים מזינים כגון ברזל ישירות 4,13,14 חלבוני מארח אנושיים.
Autotransporters השייכים למערכת הפרשת סוג V של חיידקים גראם שליליים והם בטא חבית OMPs המורכבות של תחום β-חבית (בדרך כלל 12-גדילי כמו עם אסטה ו ESPP) ואת תחום הנוסע כי הוא גם מופרש או שהוצג בכנס פני השטח של התא 15,16 (איור 3). OMPs β-החבית אלה לעתים קרובות משמש תפקידים חשובים בהישרדות תא ארסי עם תחום הנוסעים המשרת גם בתור פרוטאז, adhesin, ו / או EF אחרfector שמתווך בפתוגנזה.
שיטות מבנית כגון קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן, ספקטרוסקופיה NMR, במיקרוסקופ אלקטרונים (EM) מאפשרים לנו לקבוע מודלים עבור OMPs ברזולוציה אטומית אשר בתורו יכול לשמש כדי לפענח בדיוק איך הם מתפקדים בתוך הממברנה החיצונית. מידע שלא יסולא בפז מצב זה יכול לשמש לפיתוח תרופות חיסון אם זה אפשרי. לדוגמה, חלבון מחייב transferrin (TbpA) נמצא על פני השטח של Neisseria והוא נחוץ לצורך בפתוגנזה כי הוא נקשר transferrin אדם ישירות ולאחר מכן שואבת ומייבא את ברזל להישרדות משלו. ללא TbpA, Neisseria לא יכול לחטט ברזל מהמארח האדם ניתנים שאינם פתוגניים. לאחר המבנה הגבישי של transferrin אדם כבול TbpA 4 נפתר, זה הפך להיות הרבה יותר ברור איך שני חלבונים הקשורים, באילו אזורים של TbpA בתיווך האינטראקציה, מה שאריות היו חשובים להפקת ברזל על ידי TbpA, ואיך אפשר לפתח תרופה נגד Neisseria מיקוד TbpA. לכן, בהתחשב בחשיבות של OMPs β-לחבית גראם שלילי חיידקים להישרדות בפתוגנזה, כמו גם במיטוכונדריה ותפקוד הכלורופלסט, ואת הצורך במידע מבני נוסף על מעמד ייחודי זה של חלבונים בממברנה ואת המערכות שבן הוא פועלים , מוצגים פרוטוקולים כללי כשהמטרה להביע וטיהור OMPs היעד ברמות גבוהות לאפיון על ידי שיטות מבניות.
Protocol
Representative Results
Discussion
β-חבית OMPs משמש תפקידים חיוניים חיידקים גראם שלילי, מיטוכונדריה כלורופלסטים והם יעדים חשובים לניתוח מבני המציעים שפע של מידע על מנגנונים מולקולריים מהותיים שהוא ממברנות החיצוני של האברונים השונים הללו. עם זאת, מייצרת מספיק דגימה לצורך ביצוע אנליזה מבנית אינו תמיד בר…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Herve Celia of the CNRS for providing the UV images and Chris Dettmar and Garth Simpson in the Department of Chemistry at Purdue University for providing the SONICC images. We would like to acknowledge funding from the National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases and the Intramural Research Program at the National Institutes of Health. Additionally, we would like to acknowledge additional funding from the National Institute of General Medical Sciences (A.M.S. and C.J.), National Institute of Allergy and Infectious Diseases (N.N. 1K22AI113078-01), and the Department of Biological Sciences at Purdue University (N.N.).
Materials
| Crystallization Robot | TTP Labtech, Art Robbins | – | Any should work here, except for LCP crystallization |
| PCR thermocycler | Eppendorf, BioRad | – | |
| Media Shaker | New Brunswick, Infors HT | – | |
| UV-vis spectrometer | Eppendorf | – | |
| SDS-PAGE apparatus | BioRad | 1645050, 1658005 | |
| SDS-PAGE and native gels | BioRad, Life Technologies | 4561084, EC6035BOX (BN1002BOX) | |
| AkTA Prime | GE Healthcare | – | |
| AkTA Purifier | GE Healthcare | – | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | – | |
| Centrifuge (low-medium speed) | Beckman-Coulter | – | |
| Ultracentrifuge (high speed) | Beckman-Coulter | – | |
| SS34 rotor | Sorvall | – | |
| Type 45 Ti rotor | Beckman-Coulter | – | |
| Type 70 Ti rotor | Beckman-Coulter | – | |
| Dounce homogenizer | Fisher Scientific | 06 435C | |
| Emulsiflex | Avestin | – | |
| Dialysis tubing | Sigma | D9652 | |
| LCP tools | Hamilton, TTP Labtech | – | |
| VDX 24 well plates | Hampton Research | HR3-172 | |
| Sandwich plates | Hampton Research, Molecular Dimensions | HR3-151, MD11-50 (MD11-53) | |
| Grace Crystallization sheets | Grace Bio-Labs | 875238 | |
| HiPrep S300 HR column | GE Healthcare | 17-1167-01 | |
| Q-Sepharose column | GE Healthcare | 17-0510-01 | |
| Crystallization screens | Hampton Research, Qiagen, Molecular Dimensions | – | |
| Gas-tight syringe (100 mL) | Hamilton | ???? |
References
- Walther, D. M., Rapaport, D., Tommassen, J. Biogenesis of beta-barrel membrane proteins in bacteria and eukaryotes: evolutionary conservation and divergence. Cell Mol Life Sci. 66, 2789-2804 (2009).
- Ricci, D. P., Silhavy, T. J. The Bam machine: A molecular cooper. Biochim Biophys Acta. 1818, 1067-1084 (2012).
- Hagan, C. L., Silhavy, T. J., Kahne, D. beta-Barrel membrane protein assembly by the Bam complex. Ann Rev of Biochem. 80, 189-210 (2011).
- Noinaj, N., et al. Structural basis for iron piracy by pathogenic Neisseria. Nature. 483, 53-58 (2012).
- Noinaj, N., et al. Structural insight into the biogenesis of beta-barrel membrane proteins. Nature. 501, 385-390 (2013).
- Gatzeva-Topalova, P. Z., Walton, T. A., Sousa, M. C. Crystal structure of YaeT: conformational flexibility and substrate recognition. Structure. 16, 1873-1881 (2008).
- Kim, S., et al. Structure and function of an essential component of the outer membrane protein assembly machine. Science. 317, 961-964 (2007).
- Geibel, S., Procko, E., Hultgren, S. J., Baker, D., Waksman, G. Structural and energetic basis of folded-protein transport by the FimD usher. Nature. 496, 243-246 (2013).
- Phan, G., et al. Crystal structure of the FimD usher bound to its cognate FimC-FimH substrate. Nature. 474, 49-53 (2011).
- van den Berg, B., Black, P. N., Clemons, W. M., Rapoport, T. A. Crystal structure of the long-chain fatty acid transporter FadL. Science. 304, 1506-1509 (2004).
- Fairman, J. W., Noinaj, N., Buchanan, S. K. The structural biology of beta-barrel membrane proteins: a summary of recent reports. Curr Op Struct Bio. 21, 523-531 (2011).
- Noinaj, N., Guillier, M., Barnard, T. J., Buchanan, S. K. TonB-dependent transporters: regulation, structure, and function. Ann Rev of Micro. 64, 43-60 (2010).
- Siburt, C. J., et al. Hijacking transferrin bound iron: protein-receptor interactions involved in iron transport in N. gonorrhoeae. Metallomics. 1, 249-255 (2009).
- Cornelissen, C. N., Hollander, A. TonB-Dependent Transporters Expressed by Neisseria gonorrhoeae. Front in Micro. 2 (117), (2011).
- Dautin, N., Bernstein, H. D. Protein secretion in gram-negative bacteria via the autotransporter pathway. Ann Rev of Micro. 61, 89-112 (2007).
- Leo, J. C., Grin, I., Linke, D. Type V secretion: mechanism(s) of autotransport through the bacterial outer membrane. Phil Trans of the Royal Soc of London. Series B, Biological Sciences. 367, 1088-1101 (2012).
- Buchanan, S. K., Yamashita, S., Fleming, K. G., Engelman, E. H., Tamm, L. K. . Comprehensive Biophysics. 5, 139-163 (2011).
- Buchanan, S. K., et al. Structure of colicin I receptor bound to the R-domain of colicin Ia: implications for protein import. EMBO J. 26, 2594-2604 (2007).
- Yamashita, S., et al. Structural insights into Ail-mediated adhesion in Yersinia pestis. Structure. 19, 1672-1682 (2011).
- Aslanidis, C., de Jong, P. J. Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Res. 18, 6069-6074 (1990).
- Haun, R. S., Serventi, I. M., Moss, J. Rapid reliable ligation-independent cloning of PCR products using modified plasmid vectors. BioTechniques. 13, 515-518 (1992).
- Rosenbusch, J. P. Characterization of the major envelope protein from Escherichia coli. Regular arrangement on the peptidoglycan and unusual dodecyl sulfate binding. J Biol Chem. 249, 8019-8029 (1974).
- Barnard, T. J., Wally, J. L., Buchanan, S. K., Coligan, J. E. Crystallization of integral membrane proteins. Curr Prot in Prot Science. Chapter 17, Unit 17 19 (2007).
- Ujwal, R., Abramson, J. High-throughput crystallization of membrane proteins using the lipidic bicelle method. JoVE. , e3383 (2012).
- Faham, S., Ujwal, R., Abramson, J., Bowie, J. U. Practical Aspects of Membrane Proteins Crystallization in Bicelles. Curr Topics in Membranes. 63, 111-127 (2009).
- Li, D., Boland, C., Walsh, K., Caffrey, M. Use of a robot for high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases. JoVE. , e4000 (2012).
- Liu, W., Cherezov, V. Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases. JoVE. , (2011).
- Buchanan, S. K. Overexpression and refolding of an 80-kDa iron transporter from the outer membrane of Escherichia coli. Biochem Soc Trans. 27, 903-908 (1999).
- Buchanan, S. K. Beta-barrel proteins from bacterial outer membranes: structure, function and refolding. Curr Op in Struct Bio. 9, 455-461 (1999).
- Stanley, A. M., Fleming, K. G. The process of folding proteins into membranes: challenges and progress. Arch of Biochem and Biophysics. 469, 46-66 (2008).
- Pautsch, A., Schulz, G. E. Structure of the outer membrane protein A transmembrane domain. Nature Struct Bio. 5, 1013-1017 (1998).
- Cowan, S. W., et al. The structure of OmpF porin in a tetragonal crystal form. Structure. 3, 1041-1050 (1995).
- Ujwal, R., et al. The crystal structure of mouse VDAC1 at 2.3 A resolution reveals mechanistic insights into metabolite gating. PNAS. 105, 17742-17747 (2008).
- Robert, V., et al. Assembly factor Omp85 recognizes its outer membrane protein substrates by a species-specific C-terminal motif. PLoS Bio. 4, e377 (2006).
- Paramasivam, N., Habeck, M., Linke, D. Is the C-terminal insertional signal in Gram-negative bacterial outer membrane proteins species-specific or not?. BMC Genomics. 13, 510 (2012).
- Agah, S., Faham, S. Crystallization of membrane proteins in bicelles. Methods in Mol Bio. 914, 3-16 (2012).
- Ujwal, R., Bowie, J. U. Crystallizing membrane proteins using lipidic bicelles. Methods. 55, 337-341 (2011).
- Cherezov, V. Lipidic cubic phase technologies for membrane protein structural studies. Cur Op in Struct Bio. 21, 559-566 (2011).
- Luecke, H., Schobert, B., Richter, H. T., Cartailler, J. P., Lanyi, J. K. Structure of bacteriorhodopsin at 1.55 A resolution. J Mol Biol. 291, 899-911 (1999).
- Kato, H. E., et al. Crystal structure of the channelrhodopsin light-gated cation channel. Nature. 482, 369-374 (2012).
- White, J. F., et al. Structure of the agonist-bound neurotensin receptor. Nature. 490, 508-513 (2012).
- Cherezov, V., et al. High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor. Science. 318, 1258-1265 (2007).
- Rasmussen, S. G., et al. Crystal structure of the beta2 adrenergic receptor-Gs protein complex. Nature. 477, 549-555 (2011).
- Haupert, L. M., Simpson, G. J. Screening of protein crystallization trials by second order nonlinear optical imaging of chiral crystals (SONICC). Methods. 55, 379-386 (2011).
