Fra konstruerer Crystals - Mot Struktur Bestemmelse av β-fat ytre membranproteiner

Summary

β-barrel outer membrane proteins (OMPs) serve many functions within the outer membranes of Gram-negative bacteria, mitochondria, and chloroplasts. Here, we hope to alleviate a known bottleneck in structural studies by presenting protocols for the production of β-barrel OMPs in sufficient quantities for structure determination by X-ray crystallography or NMR spectroscopy.

Abstract

Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% percent of known structures. There are two types of membrane proteins, α-helical and β-barrel. While α-helical membrane proteins can be found in nearly all cellular membranes, β-barrel membrane proteins can only be found in the outer membranes of mitochondria, chloroplasts, and Gram-negative bacteria. One common bottleneck in structural studies of membrane proteins in general is getting enough pure sample for analysis. In hopes of assisting those interested in solving the structure of their favorite β-barrel outer membrane protein (OMP), general protocols are presented for the production of target β-barrel OMPs at levels useful for structure determination by either X-ray crystallography and/or NMR spectroscopy. Here, we outline construct design for both native expression and for expression into inclusion bodies, purification using an affinity tag, and crystallization using detergent screening, bicelle, and lipidic cubic phase techniques. These protocols have been tested and found to work for most OMPs from Gram-negative bacteria; however, there are some targets, particularly for mitochondria and chloroplasts that may require other methods for expression and purification. As such, the methods here should be applicable for most projects that involve OMPs from Gram-negative bacteria, yet the expression levels and amount of purified sample will vary depending on the target OMP.

Introduction

β-fat OMP kan bare finnes i de ytre membraner av mitokondrier, kloroplaster, og Gram-negative bakterier ^1-3. Mens de tjener lignende roller som a-heliks-proteiner, de har en helt annen fold som består av en sentral membran-forankret β-fat domene som strekker seg fra 8-26 antiparallelle P-tråder med hver streng som blir intimt knyttet til de to nabotråder (figur 1 og 2). Den første og siste tråder av β-fat domene deretter kommuniserer med hverandre, nesten utelukkende på en anti-parallell måte (med unntak av mitokondrielle VDAC), for å lukke og forsegle β-fat domene fra den omgivende membran. Alle β-barrel OMPer har ekstracellulære løkker av forskjellig sekvens og lengde som spiller en viktig rolle i ligand interaksjoner og / eller protein-protein kontakter med disse løkker og til å være så store som 75 rester, slik som funnet i transferrin Neisserial binding protein A (TBPA) ^4. β-fat OMP kan også ha N-terminale eller C-terminale periplasmatiske utvidelser som fungerer som flere domener for protein funksjonelle formål (f.eks Bama ^5-7, fimd ^8,9, Fadl ^10). Selv om mange typer av β-fat OMPer eksistere ^11, to av de vanligste typene er beskrevet nedenfor som eksempler for de som er mindre kjent med banen (1) TonB avhengige transportører og (2) autotransporters.

TonB-avhengige transportører (f.eks FEPA, TBPA, BtuB, Cir, etc.) er avgjørende for nærings import og inneholder en N-terminal plugg domene bestående av ~ 150 rester som er funnet gjemt inne i en C-terminal 22-strandet β- fat domene innebygd i den ytre membran ¹² (figur 3). Mens denne pluggen domene hindrer underlaget fra fritt passere gjennom fat domene, underlaget bindende induserer en konformasjonsendring i pluggen domene thved fører til poredannelse (enten ved plugg-omleiring eller ved partiell / fullstendig utstøting av pluggen) som deretter kan lette substrat transport over den ytre membran inn i periplasmaet. TonB avhengige transportører er spesielt viktig for overlevelsen av noen patogene stammer av gram-negative bakterier slik som Neisseria meningitidis som har utviklet seg spesialiserte transportører som kapre næringsstoffer som jern direkte fra humane vertsproteiner ^4,13,14.

Autotransporters tilhører den type V sekresjon system av Gram-negative bakterier, og er p-barrel OMP-proteiner som består av en β-fat domene (typisk 12-tråder som med esta og EspP) og en passasjer domene som blir enten utskilt eller presentert på overflaten av cellen ^15,16 (figur 3). Disse β-barrel OMPer tjener ofte en viktig rolle i celleoverlevelse og virulens med passasjeren domene tjener enten som en protease, adhesin, og / eller andre effector som formidler patogenesen.

Strukturelle metoder som røntgen-krystallografi, NMR-spektroskopi og elektronmikroskopi (EM) tillater oss å bestemme modeller for OMP ved atom-oppløsning som kan i sin tur brukes til å dechiffrere nøyaktig hvordan de fungerer i den ytre membranen. Denne uvurderlig informasjon kan så brukes for narkotika og vaksineutvikling hvis det er aktuelt. For eksempel er transferrin-bindende protein A (TBPA) finnes på overflaten av Neisseria og er nødvendig for patogenesen fordi den direkte binder human transferrin og deretter trekker og importerer jernet for sin egen overlevelse. Uten TBPA kan Neisseria ikke skatte jern fra menneskelig vert og gjengis ikke-sykdomsfremkallende. Etter at krystallstrukturen til human transferrin bundet til TBPA ⁴ var løst, ble det mye tydeligere hvordan de to proteinene forbundet, hvilke områder av TBPA mediert interaksjonen, hvilke rester var viktig for jernutvinning ved TBPA, oghvordan man kan utvikle behandlingsformer mot Neisseria målretting TBPA. Derfor, gitt betydningen av β-fat OMP-proteiner i gramnegative bakterier for å overleve og patogenese, samt i mitochondria og kloroplast funksjon, og behovet for ytterligere strukturell informasjon om denne unike klasse av membranproteiner og systemene hvori de fungerer Generelle protokoller presenteres med det overordnede målet om å uttrykke og rense målet OMP på et høyt nivå for karakterisering av strukturelle metoder.

Protocol

1. Kloning og Expression Merk: For å aktivere strukturelle studier, må tilstrekkelige mengder av svært renset protein være forberedt, og dette vanligvis starter med kloning og overekspresjon av målet β-fat ytre membran protein (OMP) i E. coli (figur 4). Til dags dato, alle β-fat OMP strukturer, inkludert de strukturer for mitokondrie VDAC, er avledet fra bakterielt uttrykte protein 11. Her blir generelt presentert protokoller for kloning og uttrykkin…

Representative Results

Yiur er en TonB avhengig jern transporter som er en antatt vaksine mål mot Yersinia pestis. Det var opprinnelig identifisert ved hjelp av en microarray analyse. Her er fremgangsmåten som ble tatt for å bestemme strukturen av yiur å bruke røntgenkrystallografi skissert (figur 9). For kloning av DNA-sekvensen av yiur (minus den N-terminale signalsekvens) ble PCR-amplifisert fra genomisk DNA og subklonet inn i en vektor som inneholder en N-terminal signalsekve…

Discussion

β-fat OMP tjene viktige roller i Gram-negative bakterier, mitokondrier og kloroplaster og er viktige mål for strukturell analyse som tilbyr et vell av informasjon om viktige molekylære mekanismene ved de ytre membranene av disse respektive organeller. Imidlertid produserer nok prøve for strukturell analyse er ikke alltid enkel og derfor en generell rørledning presentert for fremstilling av tilstrekkelige mengder av mål-β-barrel OMPer for strukturbestemmelse, forklarer i detalj fremgangsmåten fra konstruksjoner t…

Materials

Crystallization Robot	TTP Labtech, Art Robbins	–	Any should work here, except for LCP crystallization
PCR thermocycler	Eppendorf, BioRad	–
Media Shaker	New Brunswick, Infors HT	–
UV-vis spectrometer	Eppendorf	–
SDS-PAGE apparatus	BioRad	1645050, 1658005
SDS-PAGE and native gels	BioRad, Life Technologies	4561084, EC6035BOX (BN1002BOX)
AkTA Prime	GE Healthcare	–
AkTA Purifier	GE Healthcare	–
Microcentrifuge	Eppendorf	–
Centrifuge (low-medium speed)	Beckman-Coulter	–
Ultracentrifuge (high speed)	Beckman-Coulter	–
SS34 rotor	Sorvall	–
Type 45 Ti rotor	Beckman-Coulter	–
Type 70 Ti rotor	Beckman-Coulter	–
Dounce homogenizer	Fisher Scientific	06 435C
Emulsiflex	Avestin	–
Dialysis tubing	Sigma	D9652
LCP tools	Hamilton, TTP Labtech	–
VDX 24 well plates	Hampton Research	HR3-172
Sandwich plates	Hampton Research, Molecular Dimensions	HR3-151, MD11-50 (MD11-53)
Grace Crystallization sheets	Grace Bio-Labs	875238
HiPrep S300 HR column	GE Healthcare	17-1167-01
Q-Sepharose column	GE Healthcare	17-0510-01
Crystallization screens	Hampton Research, Qiagen, Molecular Dimensions	–
Gas-tight syringe (100 mL)	Hamilton	????