Ex Vivo Intestinale Sacs mucosale permeabiliteit beoordelen Modellen van gastro-intestinale aandoeningen
Summary
This protocol describes the use of excised intestinal tissue preparations or “intestinal sacs” as an ex vivo model of intestinal barrier function. This model may be used to assess integrity of both the epithelial barrier and the mucous gel layer at specific intestinal sites in animal models of digestive disease.
Abstract
De epitheliale barrière de eerste aangeboren verdediging van het maagdarmkanaal en selectief regelt vervoer van het lumen aan het onderliggende weefsel compartimenten, beperkt het transport van kleine moleculen door het epitheel en bijna volledig verbod epitheliale macromoleculaire transport. Deze selectiviteit wordt bepaald door het slijmvlies gellaag, die het transport van lipofiele moleculen en zowel de apicale receptoren en strak junctional eiwitcomplexen van het epitheel beperkt. In vitro celcultuur modellen van het epitheel zijn handig, maar als voorbeeld, ze missen de complexiteit van de interacties tussen de microbiota, slijm-gel, epitheel en het immuunsysteem. Anderzijds kan in vivo evaluatie van intestinale absorptie of permeabiliteit worden uitgevoerd, maar deze assays meten totale gastrointestinale absorptie, zonder vermelding van plaatsgebondenheid. Ex vivo permeabiliteit assays met "intestinale sacs"; een snelle en gevoelige werkwijze voor het meten ofwel globaal intestinale integriteit of vergelijkende transport van een specifiek molecuul, met het extra voordeel van intestinale plaatsgebondenheid. Hier beschrijven we de bereiding van intestinale zakjes op doorlatendheid studies en de berekening van de schijnbare permeabiliteit (P app) van een molecuul in de darmwand. Deze techniek kan worden gebruikt als een methode voor de absorptie of regionale epitheliale barrière disfunctie in dierlijke modellen van gastro-intestinale aandoeningen te onderzoeken.
Introduction
De intestinale epitheliale barrière van het maagdarmkanaal is een mucosaal oppervlak geraamd op 400 m 2 in de volwassen mens. Derhalve wordt voortdurend blootgesteld aan uitdaging van microben, opgenomen geneesmiddelen, nutriënten en bacteriële toxines. De host moet niet alleen onderscheid maken tussen het aanvaardbare commensale bacteriën en potentiële pathogenen, maar beletten dat deze soorten en hun uitgescheiden moleculen die de epitheliale barrière, terwijl tegelijkertijd waardoor opname van voedingsstoffen. Zo is de rol van het darmepitheel is om als een selectieve barrière voor het luminale inhoud 1. Dit gebeurt in hoofdzaak door de epitheliale aangeboren afweersysteem op het slijmvlies, die door een reagerend biologisch systeem bestaande uit constitutieve en induceerbare mechanismen 2 optreedt.
Verlies van epitheliale barrièrefunctie een pathologie die kenmerkend is voor een aantal gastro-intestinale ziekten. In vivoonderzoek van epitheliale barrièrefunctie kan worden beoordeeld door middel van orale sondevoeding van een tracer molecule en daaropvolgende serum analyse 3. Deze techniek geeft geen indicatie van de plaats van barrière disfunctie. In vitro en ex vivo bepaling van transepithele weerstand gebruik Transwell systemen 3 respectievelijk Ussing kamers 4,5, worden gewoonlijk gebruikt als surrogaat markers van epitheliale barrièrefunctie, maar missen de bijdragende ziekte fysiologie van diermodellen 6. In dit protocol beschrijven we een ex vivo model weefselbereiding die direct en gelokaliseerde evaluatie van intestinale integriteit en die kunnen worden gebruikt om mucosale barrièrefunctie beoordeeld op meerdere niveaus mogelijk maakt. Belangrijk is dat deze techniek worden toegepast op diermodellen voor de ziekte, of kan farmacologisch worden gemanipuleerd om grondig afvragen van mucosale barrière disfunctie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier hebben we de isolatie en bereiding van intestinale zakjes gedetailleerde mucosale barrièrefunctie ex vivo te beoordelen. Intestinale sac voorbereidingen zijn in de eerste plaats zijn gebruikt in het farmaceutisch onderzoek, onderzoek naar de absorptie van kandidaat medicijnen over de darm. Echter, deze test even goed geschikt voor de studie van darmziekten. Darmdoorlaatbaarheid kan sterk verschillen per regio en site-specifieke beoordeling van de permeabiliteit zorgt voor een beter begrip van het regional…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by National Health and Medical Research Project Grant APP1021582 and a Hunter Medical Research Institute grant sponsored by Sparke Helmore/NBN Triathlon and the Estate of the late Leslie Kenneth McFarlane.
Materials
| Dekantel Non-absorbable Silk suture | Braintree Scientific | SUT-S 116 | |
| Media 199 (TC199) | Life Technologies | 11043-023 | No phenol red as this interferes with fluorescence |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 21063-045 | No phenol red as this interferes with fluorescence |
| N-acetylcysteine | Sigma Aldrich | Use at 10mM in media | |
| Small animal vascular cathether: Physiocath | Data Sciences International | 277-1-002 | |
| FITC-Dextran 4400 MW | Sigma Aldrich | FD-4 | |
| FITC-Dextran 20,000 MW | Sigma Aldrich | FD-20 | |
| FITC-Dextran 70,000 MW | Sigma Aldrich | FD-70 |
References
- Goggins, B. J., Chaney, C., Radford-Smith, G. L., Horvat, J. C., Keely, S. Hypoxia and Integrin-Mediated Epithelial Restitution during Mucosal Inflammation. Frontiers in immunology. 4, 272 (2013).
- Otte, J. M., Kiehne, K., Herzig, K. H. Antimicrobial peptides in innate immunity of the human intestine. Journal of gastroenterology. 38, 717-726 (2003).
- Robinson, A., et al. Mucosal protection by hypoxia-inducible factor prolyl hydroxylase inhibition. Gastroenterology. 134, 145-155 (2008).
- Feighery, L., et al. Increased intestinal permeability in rats subjected to traumatic frontal lobe percussion brain injury. The Journal of trauma. 64, 131-137 (2008).
- Keely, S., et al. Chloride-led disruption of the intestinal mucous layer impedes Salmonella invasion: evidence for an ‘enteric tear’ mechanism. Cellular physiology and biochemistry : international journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 28, 743-752 (2011).
- Keely, S., et al. Contribution of epithelial innate immunity to systemic protection afforded by prolyl hydroxylase inhibition in murine colitis. Mucosal immunology. 7, 114-123 (2014).
- Sourisseau, T., et al. Regulation of PCNA and cyclin D1 expression and epithelial morphogenesis by the ZO-1-regulated transcription factor ZONAB/DbpA. Mol Cell Biol. 26, 2387-2398 (2006).
- Ruehl-Fehlert, C., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice–part 1. Exp Toxicol Pathol. 55, 91-106 (2003).
- Barthe, L., Woodley, J. F., Kenworthy, S., Houin, G. An improved everted gut sac as a simple and accurate technique to measure paracellular transport across the small intestine. European journal of drug metabolism and pharmacokinetics. 23, 313-323 (1998).
- Marks, E., et al. Oral Delivery of Prolyl Hydroxylase Inhibitor: AKB-4924 Promotes Localized Mucosal Healing in a Mouse Model of Colitis. Inflammatory bowel diseases. 21, 267-275 (2015).
- Keely, S., et al. Hypoxia-inducible factor-dependent regulation of platelet-activating factor receptor as a route for gram-positive bacterial translocation across epithelia. Mol Biol Cell. 21, 538-546 (2010).
- Brayden, D. J., Bzik, V. A., Lewis, A. L., Illum, L. CriticalSorb promotes permeation of flux markers across isolated rat intestinal mucosae and Caco-2 monolayers. Pharmaceutical research. 29, 2543-2554 (2012).
- Hubbard, D., Ghandehari, H., Brayden, D. J. Transepithelial transport of PAMAM dendrimers across isolated rat jejunal mucosae in ussing chambers. Biomacromolecules. 15, 2889-2895 (2014).
- Keely, S., et al. In vitro and ex vivo intestinal tissue models to measure mucoadhesion of poly (methacrylate) and N-trimethylated chitosan polymers. Pharmaceutical research. 22, 38-49 (2005).
- Maher, S., et al. Evaluation of intestinal absorption enhancement and local mucosal toxicity of two promoters. I. Studies in isolated rat and human colonic mucosae. European journal of pharmaceutical sciences : official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 38, 291-300 (2009).
- Balda, M. S., et al. Functional dissociation of paracellular permeability and transepithelial electrical resistance and disruption of the apical-basolateral intramembrane diffusion barrier by expression of a mutant tight junction membrane protein. The Journal of cell biology. 134, 1031-1049 (1996).
- Behrens, I., Stenberg, P., Artursson, P., Kissel, T. Transport of lipophilic drug molecules in a new mucus-secreting cell culture model based on HT29-MTX cells. Pharmaceutical research. 18, 1138-1145 (2001).
- Stefka, A. T., et al. Commensal bacteria protect against food allergen sensitization. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 13145-13150 (2014).
- Keely, S., et al. Activated fluid transport regulates bacterial-epithelial interactions and significantly shifts the murine colonic microbiome. Gut microbes. 3, 250-260 (2012).
- Barrett, K. E., Keely, S. J. Chloride secretion by the intestinal epithelium: molecular basis and regulatory aspects. Annual review of physiology. 62, 535-572 (2000).
- Soni, J., et al. Rat, ovine and bovine Peyer’s patches mounted in horizontal diffusion chambers display sampling function. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 115, 68-77 (2006).
- Justino, P. F., et al. Regulatory role of Lactobacillus acidophilus on inflammation and gastric dysmotility in intestinal mucositis induced by 5-fluorouracil in mice. Cancer chemotherapy and pharmacology. , (2015).
- Tran, C. D., Sundar, S., Howarth, G. S. Dietary zinc supplementation and methotrexate-induced small intestinal mucositis in metallothionein-knockout and wild-type mice. Cancer biology & therapy. 8, 1662-1667 (2009).
- Musch, M. W., Wang, Y., Claud, E. C., Chang, E. B. Lubiprostone decreases mouse colonic inner mucus layer thickness and alters intestinal microbiota. Digestive diseases and sciences. 58, 668-677 (2013).
