Ex Vivo intestinale Sacs pour évaluer la perméabilité de la muqueuse dans les modèles de maladies gastro-intestinales
Summary
This protocol describes the use of excised intestinal tissue preparations or “intestinal sacs” as an ex vivo model of intestinal barrier function. This model may be used to assess integrity of both the epithelial barrier and the mucous gel layer at specific intestinal sites in animal models of digestive disease.
Abstract
La barrière épithéliale est la première défense innée du tractus gastro-intestinal et régule de manière sélective le transport de la lumière dans les compartiments de tissu sous-jacentes, ce qui limite le transport de petites molécules à travers l'épithélium et presque complètement interdisant le transport macromoléculaire épithéliale. Cette sélectivité est déterminée par la couche de gel muqueux, ce qui limite le transport de molécules lipophiles et les deux récepteurs apical et les complexes protéiques de jonction serrées de l'épithélium. Modèles in vitro de culture de cellules de l'épithélium sont pratiques, mais en tant que modèle, il leur manque la complexité des interactions entre le microbiote, muqueux-gel, l'épithélium et du système immunitaire. D'autre part, l'évaluation in vivo de l'absorption intestinale ou de la perméabilité peut être effectuée, mais ces dosages mesurent absorption gastro-intestinale dans l'ensemble, sans aucune indication de spécificité de site. Ex vivo en utilisant des essais de perméabilité intestinale "sacs"; sont une méthode rapide et sensible de mesurer soit l'intégrité intestinale globale ou le transport comparative d'une molécule spécifique, avec l'avantage supplémentaire de l'intestin spécificité du site. Nous décrivons ici la préparation de sacs intestinaux pour les études de perméabilité et le calcul de la perméabilité apparente (Papp) d'une molécule à travers la barrière intestinale. Cette technique peut être utilisée comme méthode d'évaluation de l'absorption du médicament, ou d'examiner dysfonctionnement de la barrière épithéliale régionale dans des modèles animaux de maladies gastro-intestinales.
Introduction
La barrière épithéliale intestinale du tractus gastro-intestinal est une surface mucosale à environ 400 m 2 chez l'adulte humain. Par conséquent, il est constamment exposé à contester des microbes, des médicaments ingérés, les nutriments et les toxines bactériennes. L'hôte doit non seulement faire la distinction entre les bactéries commensales acceptables et des agents pathogènes potentiels, mais doit empêcher ces espèces et de leurs molécules sécrétées de traverser la barrière épithéliale, tout en permettant en même temps l'absorption des nutriments. Ainsi, le rôle de l'épithélium intestinal est d'agir comme une barrière sélective le contenu luminal 1. Ceci est obtenu, en partie, par le système de défense innée à épithéliale de la muqueuse, ce qui agit à travers un système biologique sensible constitué de mécanismes constitutifs et inductibles 2.
Perte de la fonction barrière épithéliale est une pathologie qui est caractéristique d'un certain nombre de maladies gastro-intestinales. In vivoExamen de la fonction de barrière épithéliale peut être évaluée par gavage oral d'une molécule de traceur et l'analyse subséquente du sérum 3. Toutefois, cette technique présente aucune indication quant à l'emplacement du dysfonctionnement de la barrière. In vitro et ex vivo évaluation de la résistance transepitheliale Transwell en utilisant des systèmes 3 et des chambres d'Ussing 4,5 respectivement, sont couramment utilisés comme marqueurs de substitution de la fonction de barrière épithéliale, mais il leur manque la physiologie de la maladie à part entière de modèles animaux 6. Dans ce protocole, nous décrivons un modèle de préparation des tissus ex vivo qui permet une évaluation directe et localisée de l'intégrité intestinale et qui peut être utilisé pour évaluer la fonction de barrière mucosale à un certain nombre de niveaux. Fait important, cette technique peut être appliquée à des modèles animaux de la maladie, ou peut être manipulée afin de permettre le plan pharmacologique en profondeur interrogation d'un dysfonctionnement de la barrière muqueuse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous avons détaillé l'isolement et la préparation des sacs intestinaux pour évaluer la fonction de barrière mucosale ex vivo. Préparations sac intestinal ont principalement été utilisés dans la recherche pharmaceutique, en examinant l'absorption de médicaments candidats à travers l'intestin. Cependant, ce test est également bien adapté à l'étude de la maladie intestinale. la perméabilité intestinale peut varier considérablement d'une région et d'évaluation spéci…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by National Health and Medical Research Project Grant APP1021582 and a Hunter Medical Research Institute grant sponsored by Sparke Helmore/NBN Triathlon and the Estate of the late Leslie Kenneth McFarlane.
Materials
| Dekantel Non-absorbable Silk suture | Braintree Scientific | SUT-S 116 | |
| Media 199 (TC199) | Life Technologies | 11043-023 | No phenol red as this interferes with fluorescence |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 21063-045 | No phenol red as this interferes with fluorescence |
| N-acetylcysteine | Sigma Aldrich | Use at 10mM in media | |
| Small animal vascular cathether: Physiocath | Data Sciences International | 277-1-002 | |
| FITC-Dextran 4400 MW | Sigma Aldrich | FD-4 | |
| FITC-Dextran 20,000 MW | Sigma Aldrich | FD-20 | |
| FITC-Dextran 70,000 MW | Sigma Aldrich | FD-70 |
References
- Goggins, B. J., Chaney, C., Radford-Smith, G. L., Horvat, J. C., Keely, S. Hypoxia and Integrin-Mediated Epithelial Restitution during Mucosal Inflammation. Frontiers in immunology. 4, 272 (2013).
- Otte, J. M., Kiehne, K., Herzig, K. H. Antimicrobial peptides in innate immunity of the human intestine. Journal of gastroenterology. 38, 717-726 (2003).
- Robinson, A., et al. Mucosal protection by hypoxia-inducible factor prolyl hydroxylase inhibition. Gastroenterology. 134, 145-155 (2008).
- Feighery, L., et al. Increased intestinal permeability in rats subjected to traumatic frontal lobe percussion brain injury. The Journal of trauma. 64, 131-137 (2008).
- Keely, S., et al. Chloride-led disruption of the intestinal mucous layer impedes Salmonella invasion: evidence for an ‘enteric tear’ mechanism. Cellular physiology and biochemistry : international journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 28, 743-752 (2011).
- Keely, S., et al. Contribution of epithelial innate immunity to systemic protection afforded by prolyl hydroxylase inhibition in murine colitis. Mucosal immunology. 7, 114-123 (2014).
- Sourisseau, T., et al. Regulation of PCNA and cyclin D1 expression and epithelial morphogenesis by the ZO-1-regulated transcription factor ZONAB/DbpA. Mol Cell Biol. 26, 2387-2398 (2006).
- Ruehl-Fehlert, C., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice–part 1. Exp Toxicol Pathol. 55, 91-106 (2003).
- Barthe, L., Woodley, J. F., Kenworthy, S., Houin, G. An improved everted gut sac as a simple and accurate technique to measure paracellular transport across the small intestine. European journal of drug metabolism and pharmacokinetics. 23, 313-323 (1998).
- Marks, E., et al. Oral Delivery of Prolyl Hydroxylase Inhibitor: AKB-4924 Promotes Localized Mucosal Healing in a Mouse Model of Colitis. Inflammatory bowel diseases. 21, 267-275 (2015).
- Keely, S., et al. Hypoxia-inducible factor-dependent regulation of platelet-activating factor receptor as a route for gram-positive bacterial translocation across epithelia. Mol Biol Cell. 21, 538-546 (2010).
- Brayden, D. J., Bzik, V. A., Lewis, A. L., Illum, L. CriticalSorb promotes permeation of flux markers across isolated rat intestinal mucosae and Caco-2 monolayers. Pharmaceutical research. 29, 2543-2554 (2012).
- Hubbard, D., Ghandehari, H., Brayden, D. J. Transepithelial transport of PAMAM dendrimers across isolated rat jejunal mucosae in ussing chambers. Biomacromolecules. 15, 2889-2895 (2014).
- Keely, S., et al. In vitro and ex vivo intestinal tissue models to measure mucoadhesion of poly (methacrylate) and N-trimethylated chitosan polymers. Pharmaceutical research. 22, 38-49 (2005).
- Maher, S., et al. Evaluation of intestinal absorption enhancement and local mucosal toxicity of two promoters. I. Studies in isolated rat and human colonic mucosae. European journal of pharmaceutical sciences : official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 38, 291-300 (2009).
- Balda, M. S., et al. Functional dissociation of paracellular permeability and transepithelial electrical resistance and disruption of the apical-basolateral intramembrane diffusion barrier by expression of a mutant tight junction membrane protein. The Journal of cell biology. 134, 1031-1049 (1996).
- Behrens, I., Stenberg, P., Artursson, P., Kissel, T. Transport of lipophilic drug molecules in a new mucus-secreting cell culture model based on HT29-MTX cells. Pharmaceutical research. 18, 1138-1145 (2001).
- Stefka, A. T., et al. Commensal bacteria protect against food allergen sensitization. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 13145-13150 (2014).
- Keely, S., et al. Activated fluid transport regulates bacterial-epithelial interactions and significantly shifts the murine colonic microbiome. Gut microbes. 3, 250-260 (2012).
- Barrett, K. E., Keely, S. J. Chloride secretion by the intestinal epithelium: molecular basis and regulatory aspects. Annual review of physiology. 62, 535-572 (2000).
- Soni, J., et al. Rat, ovine and bovine Peyer’s patches mounted in horizontal diffusion chambers display sampling function. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 115, 68-77 (2006).
- Justino, P. F., et al. Regulatory role of Lactobacillus acidophilus on inflammation and gastric dysmotility in intestinal mucositis induced by 5-fluorouracil in mice. Cancer chemotherapy and pharmacology. , (2015).
- Tran, C. D., Sundar, S., Howarth, G. S. Dietary zinc supplementation and methotrexate-induced small intestinal mucositis in metallothionein-knockout and wild-type mice. Cancer biology & therapy. 8, 1662-1667 (2009).
- Musch, M. W., Wang, Y., Claud, E. C., Chang, E. B. Lubiprostone decreases mouse colonic inner mucus layer thickness and alters intestinal microbiota. Digestive diseases and sciences. 58, 668-677 (2013).
