मानव mesenchymal स्टेम सेल की immunomodulatory गुण (MSCs) का आकलन
Summary
मानव mesenchymal स्टेम सेल (एमएससी) के इम्यूनोमॉड्यूलेटरी गुण नैदानिक आवेदन के लिए तेजी से प्रासंगिक दिखाई देते हैं। फ्लोरोसेंट रंजक Carboxyfluorescein succinimidyl एस्टर (CFSE) के साथ पूर्व दाग MSCs और परिधीय रक्त ल्यूकोसाइट्स के सह-संस्कृति प्रणाली का उपयोग करते हुए, हम प्रेरक ल्युकोसैट प्रसार और विशिष्ट उप-जनसंख्या पर एमएससी immunomodulation की इन विट्रो मूल्यांकन का वर्णन है।
Abstract
The immunomodulatory properties of multilineage human mesenchymal stem cells (MSCs) appear to be highly relevant for clinical use towards a wide-range of immune-related diseases. Mechanisms involved are increasingly being elucidated and in this article, we describe the basic experiment to assess MSC immunomodulation by assaying for suppression of effector leukocyte proliferation. Representing activation, leukocyte proliferation can be assessed by a number of techniques, and we describe in this protocol the use of the fluorescent cellular dye carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) to label leukocytes with subsequent flow cytometric analyses. This technique can not only assess proliferation without radioactivity, but also the number of cell divisions that have occurred as well as allowing for identification of the specific population of proliferating cells and intracellular cytokine/factor expression. Moreover, the assay can be tailored to evaluate specific populations of effector leukocytes by magnetic bead surface marker selection of single peripheral blood mononuclear cell populations prior to co-culture with MSCs. The flexibility of this co-culture assay is useful for investigating cellular interactions between MSCs and leukocytes.
Introduction
मानव mesenchymal स्टेम सेल (MSCs) कुछ extramesodermal प्रजातियों से 5 के रूप में के रूप में अच्छी तरह से, हड्डी, उपास्थि, और वसा ऊतकों 1-4 की paraxial mesodermal प्रजातियों में अंतर कर सकते हैं कि दैहिक पूर्वज हैं। पहले वयस्क अस्थि मज्जा से अलग, इन multilineage पूर्वज अब नैदानिक आवेदन 9-12 के लिए अत्यधिक उत्तरदायी दिखाई देते हैं कि मजबूत इम्यूनोमॉड्यूलेटरी गुण है दिखाया, अप्रत्याशित रूप से, कई ऊतकों 6-8 में पाया गया है। Immunomodulatory प्रभाव में शामिल विस्तृत तंत्र को सक्रिय रूप से विशेष बीमारी संस्थाओं पर प्रभावी आवेदन के लिए जांच की जा रही है। Immunomodulation मूल्यांकन करने के लिए सबसे सरल तरीकों में से एक प्रेरक ल्युकोसैट प्रसार 13 के दमन के लिए आकलन कर रहा है। उत्तेजित या सक्रिय जब इस तरह के टी lymphocytes और monocytes के रूप में सबसे प्रेरक ल्यूकोसाइट्स अनोखे ढंग से पैदा करना। Immunomodulatory समारोह का आकलन किया जा सकता है जब के दमनप्रसार इसका सबूत है।
परंपरागत रूप से, प्रेरक ल्युकोसैट प्रसार डीएनए में [3 एच] thymidine निगमन का पता लगाने के द्वारा मूल्यांकन किया गया है। हालांकि, इस पद्धति की वजह से विकिरण और बाद के उपयोग के निपटान की चिंताओं के महत्वपूर्ण कमियां हैं, साथ ही जरूरत जटिल उपकरण है। सेल प्रसार का आकलन करने के लिए गैर रेडियोधर्मी assays के देखते हैं, वहीं Carboxyfluorescein succinimidyl एस्टर (CFSE) परख ऐसे अनेक प्रकार की कोशिकाओं को शामिल सह संस्कृति प्रयोगों में विशेष रूप से उपयोगी है, जो विशिष्ट सेलुलर आबादी, की पहचान के लिए अनुमति के रूप में अन्य लाभ हैं। CFSE प्रवाह cytometric विश्लेषण द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है, जो एक फ्लोरोसेंट सेलुलर डाई है। कोशिकाओं के विभाजन के रूप में, इस सेलुलर लेबल की तीव्रता आनुपातिक रूप से कमी आई है; यह न केवल समग्र सेल प्रसार के निर्धारण के लिए सक्षम बनाता है, लेकिन यह भी प्रतिदीप्ति det करने के लिए मुश्किल हो जाता है इससे पहले 8 डिवीजनों अप करने के लिए कोशिका विभाजन की संख्या पर मूल्यांकन के लिए अनुमति देता हैect के पृष्ठभूमि संकेत के खिलाफ। इसके अलावा, फ्लोरोसेंट CFSE की स्थिरता कोशिकाओं कई महीनों से 14 तक देखे जा सकते हैं कि इस तरह के लेबल की कोशिकाओं के vivo नज़र रखने के लिए अनुमति देता है।
यह परख भी प्रेरक ल्यूकोसाइट्स या की विशिष्ट आबादी के इम्यूनोमॉड्यूलेटरी समारोह के विशिष्ट प्रकार के मूल्यांकन करने के लिए अलग किया जा सकता का चुंबकीय मनका सतह मार्कर चयन प्रदर्शन से इम्यूनोमॉड्यूलेटरी ल्यूकोसाइट्स-तरह के इंटरल्यूकिन 10 (आईएल -10) का निर्माण CD14 + monocytes 15 के रूप में एमएससी प्रेरित पहले या उचित रूप में सह संस्कृति बाद ब्याज की सेल आबादी। हमारी प्रोटोकॉल (प्रवाह चार्ट से पता चला (प्रवाह चार्ट चित्र 1 में दिखाया गया है) प्रेरक ल्यूकोसाइट्स पर MSCS की immunomodulatory प्रभाव का आकलन करने के बुनियादी परख और अल्लोजीनिक सीडी 4 + प्रेरक टी lymphocytes पर एमएससी प्रेरित ल्युकोसैट immunomodulation के मूल्यांकन के लिए इस बुनियादी परख पर एक बदलाव का वर्णन चित्रा 4 में)।
Protocol
Representative Results
Discussion
Increasingly, the immunomodulatory properties of MSCs are being translated into clinical use more rapidly than the multilineage capacity of these stem cells18-20. Thus, co-culture techniques of MSCs with leukocytes and assays to evaluate immune function are important to further delineate the specific mechanisms involved in these properties for optimizing effective therapeutic application.
One of the most critical technical aspects for success in these assays is having adequate PBMC…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported in part by grants from NHRI (CS-104-PP-06 to B.L.Y.).
Materials
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 71-7167-00 AG | Density grandient for isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) |
| Vibrant CFDA-SE Cell Tracer Kit (CFSE) | Life Technologies | V12883 | Cellular label for detection of cell division |
| Phytoagglutinin (PHA) | Sigma | L8902 | Activation of human PBMCs |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/28 | Life Technologies | 111.32D | Activation of human T lymphocytes, e.g. CD4+ T cells, CD8+ T cells,etc. |
| autoMACS™ Separator | Miltenyi Biotec | autoMACS™ Separator | Magnetic based cell separator |
| autoMACS® Columns | Miltenyi Biotec | 130-021-101 | separation columns |
| CD14 microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | For positive selection of CD14+ human monocytes and macrophages from PBMCs |
| CD4 microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | For positive selection of CD4+ human T lymphocytes from PBMCs |
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 11875 | Human PBMC/leukocyte culture medium |
| DMEM, Low glucose, pyruvate | Life Technologies | 11885 | Human mesenchymal stem cell (MSC) culture medium |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030-081 | Supplementation for MSC complete medium |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | Supplementation for PBMC/leukocyte and MSC complete medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | 1) Hyclone, for MSC culture 2) Life Technologies, for all other cells (i.e. PBMCs, specific leukocyte populations) | 1) SH30070.03M 2) 10091-148 | Pre-test lots for support of MSC in vitro culture |
| 24-well cell culture plate | Corning | COR3524 | Co-culture plate |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | 430291 | Isolation PBMCs from whole blood by Ficoll-Paque PLUS |
| 15 mL centrifuge tube | Corning | 430766 | Collection of the labeled and unlabeled cell fractions |
| Round-bottom tubes | BD Falcon | 352008 | Collection of cells for flow cytometric analysis |
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