Valutazione della proprietà immunomodulanti di cellule staminali mesenchimali umane (MSC)
Summary
Le proprietà immunomodulanti di cellule umane staminali mesenchimali (MSC) appaiono sempre più rilevante per l'applicazione clinica. Utilizzando un sistema di co-coltura di cellule staminali mesenchimali e leucociti del sangue periferico pre-colorati con il colorante fluorescente carbossifluoresceina succinimidil estere (CFSE), si descrive la valutazione in vitro di MSC immunomodulazione sulla proliferazione dei leucociti effettrici e sottopopolazioni specifiche.
Abstract
The immunomodulatory properties of multilineage human mesenchymal stem cells (MSCs) appear to be highly relevant for clinical use towards a wide-range of immune-related diseases. Mechanisms involved are increasingly being elucidated and in this article, we describe the basic experiment to assess MSC immunomodulation by assaying for suppression of effector leukocyte proliferation. Representing activation, leukocyte proliferation can be assessed by a number of techniques, and we describe in this protocol the use of the fluorescent cellular dye carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) to label leukocytes with subsequent flow cytometric analyses. This technique can not only assess proliferation without radioactivity, but also the number of cell divisions that have occurred as well as allowing for identification of the specific population of proliferating cells and intracellular cytokine/factor expression. Moreover, the assay can be tailored to evaluate specific populations of effector leukocytes by magnetic bead surface marker selection of single peripheral blood mononuclear cell populations prior to co-culture with MSCs. The flexibility of this co-culture assay is useful for investigating cellular interactions between MSCs and leukocytes.
Introduction
Le cellule staminali mesenchimali umane (MSC) sono progenitrici somatiche che possono differenziarsi in lignaggi mesodermiche parassiali di ossa, cartilagine e tessuto adiposo 1-4, così come ad alcuni lignaggi extramesodermal 5. In primo luogo isolato dal midollo osseo adulto, questi progenitori multilineage ora sono state trovate in numerosi tessuti 6-8 e, inaspettatamente, dimostrato di avere forti proprietà immunomodulanti che sembrano altamente suscettibili di applicazione clinica 9-12. Meccanismi dettagliati coinvolti negli effetti immunomodulatori sono attivamente indagati dell'effettiva applicazione in entità patologiche specifiche. Uno dei modi più semplici per valutare immunomodulazione è valutando per la soppressione di effettori leucociti proliferazione 13. La maggior parte dei leucociti effettrici quali T linfociti e monociti proliferano prodigiosamente quando stimolato o attivato. Funzione immunomodulante può essere valutata quando la soppressione diproliferazione è evidenziato.
Tradizionalmente, effettore leucociti proliferazione è stata valutata mediante rilevamento di [3 H] timidina nel DNA. Tuttavia, questo metodo ha svantaggi significativi a causa delle preoccupazioni di radiazioni e smaltimento post-utilizzo, così come il complesso attrezzature necessarie. Mentre ci sono saggi non radioattivi per valutare la proliferazione cellulare, l'estere carboxyfluorescein succinimidil (CFSE) test ha anche altri vantaggi come ad esempio consentendo l'identificazione delle popolazioni cellulari specifiche, il che è particolarmente utile in esperimenti di co-coltura di cellule che coinvolgono molteplici tipi. CFSE è un colorante cellulare fluorescente che può essere valutata mediante l'analisi di citometria di flusso. Come le cellule si dividono, l'intensità di questa etichetta cellulare diminuisce proporzionalmente; questo permette non solo la determinazione della proliferazione cellulare complessiva ma anche permette di valutare il numero di divisioni cellulari fino a 8 divisioni prima fluorescenza diventa difficile detect contro segnale di fondo. Inoltre, la stabilità della fluorescenza CFSE permette il monitoraggio in vivo di cellule marcate tali che le cellule possono essere visualizzati fino a molti mesi 14.
Questo test può anche essere variata per valutare specifici tipi di leucociti effettrici o la funzione immunomodulante di specifiche popolazioni di MSC indotta leucociti-come immunomodulatori l'interleuchina-10 (IL-10), la produzione di monociti CD14 + 15 eseguendo magnetico tallone selezione marcatore superficie popolazioni di cellule di interesse prima o dopo co-coltura a seconda dei casi. Il nostro protocollo descrive il saggio base di valutare gli effetti immunomodulatorie delle MSC sui leucociti effettrici (diagramma di flusso mostrato nella Figura 1) e una variazione su questo test base per la valutazione di MSC indotta immunomodulazione leucociti su allogeniche CD4 + effettrici linfociti T (diagramma di flusso mostrato in figura 4).
Protocol
Representative Results
Discussion
Increasingly, the immunomodulatory properties of MSCs are being translated into clinical use more rapidly than the multilineage capacity of these stem cells18-20. Thus, co-culture techniques of MSCs with leukocytes and assays to evaluate immune function are important to further delineate the specific mechanisms involved in these properties for optimizing effective therapeutic application.
One of the most critical technical aspects for success in these assays is having adequate PBMC…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported in part by grants from NHRI (CS-104-PP-06 to B.L.Y.).
Materials
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 71-7167-00 AG | Density grandient for isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) |
| Vibrant CFDA-SE Cell Tracer Kit (CFSE) | Life Technologies | V12883 | Cellular label for detection of cell division |
| Phytoagglutinin (PHA) | Sigma | L8902 | Activation of human PBMCs |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/28 | Life Technologies | 111.32D | Activation of human T lymphocytes, e.g. CD4+ T cells, CD8+ T cells,etc. |
| autoMACS™ Separator | Miltenyi Biotec | autoMACS™ Separator | Magnetic based cell separator |
| autoMACS® Columns | Miltenyi Biotec | 130-021-101 | separation columns |
| CD14 microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | For positive selection of CD14+ human monocytes and macrophages from PBMCs |
| CD4 microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | For positive selection of CD4+ human T lymphocytes from PBMCs |
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 11875 | Human PBMC/leukocyte culture medium |
| DMEM, Low glucose, pyruvate | Life Technologies | 11885 | Human mesenchymal stem cell (MSC) culture medium |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030-081 | Supplementation for MSC complete medium |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | Supplementation for PBMC/leukocyte and MSC complete medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | 1) Hyclone, for MSC culture 2) Life Technologies, for all other cells (i.e. PBMCs, specific leukocyte populations) | 1) SH30070.03M 2) 10091-148 | Pre-test lots for support of MSC in vitro culture |
| 24-well cell culture plate | Corning | COR3524 | Co-culture plate |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | 430291 | Isolation PBMCs from whole blood by Ficoll-Paque PLUS |
| 15 mL centrifuge tube | Corning | 430766 | Collection of the labeled and unlabeled cell fractions |
| Round-bottom tubes | BD Falcon | 352008 | Collection of cells for flow cytometric analysis |
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