Оценка иммуномодулирующими свойствами человеческой мезенхимальных стволовых клеток (МСК)
Summary
Иммуномодулирующих свойств мезенхимальных стволовых клеток человека (MSC) появляются все более актуальным для клинического применения. Используя систему совместного культивирования МСК и лейкоцитов периферической крови до окрашенных с карбоксифлуоресцеина флуоресцентный краситель сукцинимидиловым эфира (CFSE), мы опишем оценку MSC иммуномодуляцию в пробирке на пролиферацию эффекторных лейкоцитов и конкретных групп населения.
Abstract
The immunomodulatory properties of multilineage human mesenchymal stem cells (MSCs) appear to be highly relevant for clinical use towards a wide-range of immune-related diseases. Mechanisms involved are increasingly being elucidated and in this article, we describe the basic experiment to assess MSC immunomodulation by assaying for suppression of effector leukocyte proliferation. Representing activation, leukocyte proliferation can be assessed by a number of techniques, and we describe in this protocol the use of the fluorescent cellular dye carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) to label leukocytes with subsequent flow cytometric analyses. This technique can not only assess proliferation without radioactivity, but also the number of cell divisions that have occurred as well as allowing for identification of the specific population of proliferating cells and intracellular cytokine/factor expression. Moreover, the assay can be tailored to evaluate specific populations of effector leukocytes by magnetic bead surface marker selection of single peripheral blood mononuclear cell populations prior to co-culture with MSCs. The flexibility of this co-culture assay is useful for investigating cellular interactions between MSCs and leukocytes.
Introduction
Мезенхимальных стволовых клеток человека (МСК) в соматических предшественники, которые могут дифференцироваться в приосевой мезодермальных линий кости, хряща, и жировой ткани 1-4, а также несколько линий extramesodermal 5. Впервые выделен из костного мозга взрослого, эти предшественники мультилинейной Были обнаружены многочисленные ткани 6-8 и, неожиданно, показано иметь сильные иммуномодулирующими свойствами, которые появляются высоко поддаются клиническому применению 9-12. Подробные механизмы, участвующие в иммуномодулирующих эффектов активно расследуется для эффективного применения на конкретных нозологических единиц. Один из самых простых способов оценки иммуномодуляцию является оценка для подавления лейкоцитов эффекторной распространения 13. Большинство эффекторные лейкоциты, такие как Т-лимфоцитов и моноцитов пролиферируют необыкновенно при стимуляции или активированный. Функция Иммуномодулирующая может быть оценена, когда подавлениеРаспространение свидетельствует.
Традиционно, эффектор лейкоцитов пролиферацию оценивали путем определения [3 H] тимидина в ДНК. Тем не менее, этот метод имеет существенные недостатки из-за озабоченности излучения и после применения распоряжении, а также комплексное оборудование, необходимое. В то время как есть нерадиоактивные анализы для оценки клеточной пролиферации, то карбоксифлуоресцеин сукцинимидиловый эфир (CFSE) анализ имеет и другие преимущества, такие как возможность для идентификации конкретных клеточных популяций, что особенно полезно в сокультуры экспериментов с участием нескольких типов клеток. CFSE представляет собой флуоресцентный краситель, который сотовой может быть оценена с помощью анализа проточной цитометрии. Как клетки делятся, интенсивность этой клеточной этикетки уменьшается пропорционально; Это не только позволяет определять пролиферации клеток общего, но также позволяет оценить по количеству делений до 8 делений прежде, чем флуоресценция становится трудно опрЭСТ против фонового сигнала. Кроме того, стабильность флуоресцентного CFSE позволяет отслеживать в естественных меченых клеток таких, что клетки могут быть визуализированы до многих месяцев 14.
Этот анализ также может изменяться для оценки конкретных типов эффекторных лейкоцитов или функции иммуномодулирующего конкретных популяций MSC-индуцированной иммуномодулирующие лейкоциты, такие как интерлейкин-10 (IL-10) получение CD14 + моноцитов 15, выполняя магнитное шарик выбор поверхности маркера сотовые популяции интерес до или после совместного культивирования в соответствующих случаях. Наш протокол описывает основные анализа в оценке иммуномодулирующих эффектов МСК на эффекторных лейкоцитов (схема показана на рисунке 1) и вариации на этой основной тест для оценки MSC-индуцированной лейкоцитов иммуномодуляцию на аллогенных CD4 + эффекторных Т-лимфоцитов (схема показано на рисунке 4).
Protocol
Representative Results
Discussion
Increasingly, the immunomodulatory properties of MSCs are being translated into clinical use more rapidly than the multilineage capacity of these stem cells18-20. Thus, co-culture techniques of MSCs with leukocytes and assays to evaluate immune function are important to further delineate the specific mechanisms involved in these properties for optimizing effective therapeutic application.
One of the most critical technical aspects for success in these assays is having adequate PBMC…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported in part by grants from NHRI (CS-104-PP-06 to B.L.Y.).
Materials
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 71-7167-00 AG | Density grandient for isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) |
| Vibrant CFDA-SE Cell Tracer Kit (CFSE) | Life Technologies | V12883 | Cellular label for detection of cell division |
| Phytoagglutinin (PHA) | Sigma | L8902 | Activation of human PBMCs |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/28 | Life Technologies | 111.32D | Activation of human T lymphocytes, e.g. CD4+ T cells, CD8+ T cells,etc. |
| autoMACS™ Separator | Miltenyi Biotec | autoMACS™ Separator | Magnetic based cell separator |
| autoMACS® Columns | Miltenyi Biotec | 130-021-101 | separation columns |
| CD14 microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | For positive selection of CD14+ human monocytes and macrophages from PBMCs |
| CD4 microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | For positive selection of CD4+ human T lymphocytes from PBMCs |
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 11875 | Human PBMC/leukocyte culture medium |
| DMEM, Low glucose, pyruvate | Life Technologies | 11885 | Human mesenchymal stem cell (MSC) culture medium |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030-081 | Supplementation for MSC complete medium |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | Supplementation for PBMC/leukocyte and MSC complete medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | 1) Hyclone, for MSC culture 2) Life Technologies, for all other cells (i.e. PBMCs, specific leukocyte populations) | 1) SH30070.03M 2) 10091-148 | Pre-test lots for support of MSC in vitro culture |
| 24-well cell culture plate | Corning | COR3524 | Co-culture plate |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | 430291 | Isolation PBMCs from whole blood by Ficoll-Paque PLUS |
| 15 mL centrifuge tube | Corning | 430766 | Collection of the labeled and unlabeled cell fractions |
| Round-bottom tubes | BD Falcon | 352008 | Collection of cells for flow cytometric analysis |
References
- Friedenstein, A. J. Precursor cells of mechanocytes. Int Rev Cytol. 47, 327-359 (1976).
- Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284, 143-147 (1999).
- Prockop, D. J. Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues. Science. 276, 71-74 (1997).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8, 315-317 (2006).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7, 211-228 (2001).
- Yen, B. L., et al. Isolation of multipotent cells from human term placenta. Stem Cells. 23, 3-9 (2005).
- Erices, A., Conget, P., Minguell, J. J. Mesenchymal progenitor cells in human umbilical cord blood. Br J Haematol. 109, 235-242 (2000).
- Bartholomew, A., et al. Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo. Exp Hematol. 30, 42-48 (2002).
- Chang, C. J., et al. Placenta-derived multipotent cells exhibit immunosuppressive properties that are enhanced in the presence of interferon-gamma. Stem Cells. 24, 2466-2477 (2006).
- Uccelli, A., Moretta, L., Pistoia, V. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nat Rev Immunol. 8, 726-736 (2008).
- Chen, P. M., Yen, M. L., Liu, K. J., Sytwu, H. K., Yen, B. L. Immunomodulatory properties of human adult and fetal multipotent mesenchymal stem cells. J Biomed Sci. 18, 49-59 (2011).
- Muul, L. M., et al. Measurement of proliferative responses of cultured lymphocytes. Curr Protoc Immunol. , (2011).
- Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nat Protoc. 2, 2049-2056 (2007).
- Chen, P. M., et al. Induction of immunomodulatory monocytes by human mesenchymal stem cell-derived hepatocyte growth factor through ERK1/2. J Leukoc Biol. 96, 295-303 (2014).
- Oughton, J. A., Kerkvliet, N. I., Costa, L. G., Davila, J. C., Lawrence, D. A., Reed, D. J., Will, Y. UNIT 18.8 Immune cell phenotyping using flow cytometry. Curr Protoc Toxicol. , 18.8.1-18.8.24 (2005).
- Phelan, M. C., Lawler, G., Robinson, J. P., et al. APPENDIX 3A Cell counting. Curr Protoc Cytom. , A.3A.1-A.3A.4 (2001).
- Gebler, A., Zabel, O., Seliger, B. The immunomodulatory capacity of mesenchymal stem cells. Trends Mol Med. 18, 128-134 (2012).
- Le Blanc, K., et al. Mesenchymal stem cells for treatment of steroid-resistant, severe, acute graft-versus-host disease: a phase II study. Lancet. 371, 1579-1586 (2008).
- Tan, J., et al. Induction therapy with autologous mesenchymal stem cells in living-related kidney transplants: a randomized controlled trial. JAMA. 307, 1169-1177 (2012).
- Le Blanc, K., et al. Mesenchymal stem cells inhibit and stimulate mixed lymphocyte cultures and mitogenic responses independently of the major histocompatibility complex. Scand J Immunol. 57, 11-20 (2003).
- Li, X. Y., et al. Long-term culture in vitro impairs the immunosuppressive activity of mesenchymal stem cells on T cells. Mol Med Rep. 6, 1183-1189 (2012).
- Moll, G., et al. Do cryopreserved mesenchymal stromal cells display impaired immunomodulatory and therapeutic properties?. Stem Cells. 32, 2430-2442 (2012).
- Ho, P. J., Yen, M. L., Tang, B. C., Chen, C. T., Yen, B. L. H2O2 accumulation mediates differentiation capacity alteration, but not proliferative decline, in senescent human fetal mesenchymal stem cells. Antioxid Redox Signal. 18, 1895-1905 (2013).
