Generazione di culture geneticamente modificate pelle organotipiche Uso devitalizzate derma umano

Summary

The goal of this paper is to provide a comprehensive and detailed protocol on how to generate genetically modified human organotypic skin from epidermal keratinocytes and devitalized human dermis.

Abstract

Colture organotipiche permettono la ricostituzione di un ambiente 3D critico per interazioni di contatto cellula-cellula e cellula-matrice che imita la funzione e la fisiologia dei loro omologhi dei tessuti in vivo. Questo è esemplificato da culture pelle organotipiche che riassume fedelmente la differenziazione epidermica e il programma di stratificazione. Cheratinociti epidermici primari umani sono geneticamente manipolabile attraverso retrovirus in cui i geni possono essere facilmente overexpressed o abbattuti. Questi cheratinociti geneticamente modificati possono poi essere utilizzati per rigenerare epidermide umana in colture organotipiche della pelle che forniscono un modello potente per studiare percorsi genetici di crescita epidermico impattante, la differenziazione e la progressione della malattia. I protocolli qui presentati descrivono metodi per preparare derma umano devitalizzati nonché manipolare geneticamente cheratinociti umani primari per generare culture organotipiche pelle. Pelle umana rigenerata può essere utilizzato in downstrapplicazioni EAM come il profilo di espressione genica, immunostaining, e immunoprecipitazioni cromatina seguiti da sequenziamento ad alta produttività. Così, la generazione di queste culture organotipiche pelle geneticamente modificati consentirà la determinazione di geni cruciali per mantenere l'omeostasi della pelle.

Introduction

L'epidermide umana è un epitelio stratificato che si collega al derma sottostante attraverso una matrice extracellulare noto come l'epidermide zone.The membrana basale non serve solo come una barriera impermeabile per evitare la perdita di umidità, ma anche come una prima linea di difesa per proteggere la corpo dalle sostanze estranee e tossiche ^1. Lo strato basale, che è lo strato più profondo dell'epidermide, contiene le cellule staminali epidermiche e progenitrici che danno luogo alla progenie differenziata che formano il resto dell'epidermide ^2. Come le cellule progenitrici epidermiche differenziano migrano verso l'alto per formare il primo strato di cellule differenziate note come strato spinoso ^3. Nello strato spinoso, cellule attivano l'espressione di cheratine 1 e 10, che quindi fornisce la forza di resistere allo stress fisico per gli strati differenziati dell'epidermide. Come le cellule strato spinoso ulteriormente differenziano, si muovono verso l'alto nell'epidermide a perm strato granulare che è caratterizzata dalla formazione di keratohyalin e lamellari granuli così come proteine ​​strutturali che vengono assemblati sotto la membrana plasmatica. Poiché le cellule procedere nel processo di differenziazione, le proteine ​​sotto la membrana plasmatica sono trasversali collegati tra loro, mentre i granuli vengono estrusi lamellari dalle cellule per formare una barriera lipidica ricco chiamato strato corneo ^4.

Malattie che coinvolgono alterazioni nella crescita epidermico e impatto differenziazione ~ 20% della popolazione ^5. Così, la comprensione dei meccanismi di questo processo è di grande importanza. Dal momento che la manifestazione di molte di queste malattie è subordinato cellula-cellula o cellula-matrice contatto, colture organotipiche dove l'epidermide umana è ricostituito in un ambiente 3D sono stati creati ^6-10. Questi metodi tipicamente comportano l'uso di cheratinociti primari o trasformati seminate su matrice extracellulare come devitalizzati umanaderma, Matrigel o collagene.

Per comprendere gene meccanismi di regolamentazione che sono importanti nella crescita e differenziazione epidermica, cheratinociti possono essere geneticamente manipolati tramite vettori retrovirali per atterramento o iperespressione di geni nella cultura 2D e poi ricostituito in 3D. Questi metodi sono stati ampiamente utilizzati per caratterizzare i geni coinvolti nella epidermica staminali e cellule progenitrici auto-rinnovamento e la differenziazione, nonché la progressione di neoplasia ^11-21. Qui, è previsto un protocollo approfondito su come modificare l'espressione genica in colture organotipiche epidermiche attraverso l'uso di retrovirus.

Protocol

Il protocollo pelle umana è stata effettuata in conformità con le linee guida della University of California, Ricerca Comitato Etico di San Diego. La pelle umana può essere ottenuto da campioni chirurgici scartati o comprato da banche della pelle (pelle banca è elencato nella tabella Materiali / Equipment). La posizione in cui la pelle è realizzata o età del donatore non è critico per l'esperimento finché le proteine ​​membrana basale (collagene / laminina) nel derma non…

Representative Results

Il primo passo nella generazione di pelle umana organotipica è rimuovere l'epidermide dal derma. I due settimana incubazione della pelle a 37 ° C in 4x pen / strep / PBS dovrebbe consentire la separazione del derma dall'epidermide (Figura 1A). Se la separazione dell'epidermide e del derma è difficile posizionare il tessuto a 37 ° C a 4x penna / strep / PBS per un'altra settimana e poi provare di nuovo peeling con pinze. Una delle chiavi per rigenerare il …

Discussion

La manipolazione genetica in pelle umana colture organotipiche offrono molti vantaggi a comunemente studiato 2D cellule in coltura e modelli di mouse. Culture 2D mancano i tre cellula-cellula e cellula-matrice extracellulare interazioni dimensionali si trovano in tessuti e organi intatti. Recenti studi hanno anche trovato enormi differenze tra le colture di cellule tumorali della pelle 2D e 3D con le cellule in coltura 3D che mostra molto di più somiglianze di espressione genica per la pelle umana primaria tumori ^…

Materials

Human skin	New York Firefighters Skin Bank	http://www.cornellsurgery.org/pro/services/burn-surgery/skin-bank.html
PEN/STREP	GIBCO	15140-122
amphotropic phoenix cell lines	ATCC	CRL-3213
FUGENE 6 transfection reagent	Promega	E2691
Keratinocyte Media (KCSFM)	Life Technologies	17005042
DMEM	GIBCO	11995
Ham's F12	Cambrex	12-615F
FBS	GIBCO	10437-028
Adenine	Sigma	A-9795
Cholera Toxin	Sigma	C-8052
Hydrocortisone	Calbiochem	3896
Insulin	Sigma	I-1882
EGF	Invitrogen	13247-051
Transferrin	Sigma	T-0665
Ciprofloxacin Hydrochloride	Serologicals	89-001-1
cautery	Bovie Medical Corporation	AA01
Matrigel	Corning	354234
Keratin 1 antibody	Biolegend	PRB-149P
square pegs	Arts and crafts stores
human neonatal keratinocytes	ATCC	PCS-200-010
human neonatal keratinocytes	Cell Applications	102K-05n
MSCV retroviral vector	Clontech	634401
LZRS retroviral vector	Addgene
pSuper.Retro.Puro Retroviral vector	Oligoengine	VEC-PRT-0002
hexadimethrine bromide	Sigma	H9268-5G