失活ヒト真皮を用いて遺伝子組換え器官皮膚培養物の生成
Summary
The goal of this paper is to provide a comprehensive and detailed protocol on how to generate genetically modified human organotypic skin from epidermal keratinocytes and devitalized human dermis.
Abstract
器官培養物は、それらのin vivoでの組織の対応の機能および生理学を模倣する細胞-細胞接触および細胞-マトリックス相互作用のための3D環境の再構成を可能にする重要な。これは、忠実に表皮分化と成層プログラムを再現する器官型皮膚培養が挙げられます。初代ヒト表皮角化細胞は、遺伝子が容易に過剰発現またはノックダウンすることができますレトロウイルスを介して遺伝的に操作可能です。これらの遺伝的に改変されたケラチノサイトは、次に遺伝的経路に衝突上皮細胞増殖、分化、および疾患の進行を研究するための強力なモデルを提供し、皮膚器官培養におけるヒト表皮を再生するために使用することができます。ここで紹介するプロトコルは、失活ヒト真皮を準備するだけでなく、と遺伝的に器官皮膚培養を生成するために、初代ヒトケラチノサイトを操作する方法を説明します。再生した人間の皮膚はdownstrに使用することができますこのような遺伝子発現プロファイリング、免疫染色、及びハイスループットシークエンシングに続いてクロマチン免疫沈降などのEAMアプリケーション。したがって、これらの遺伝的に改変された器官、皮膚培養物の生成は、皮膚恒常性を維持するために重要である遺伝子の決意を可能にします。
Introduction
ヒト表皮基底膜zone.Theの表皮として知られている細胞外マトリックスは、水分の損失を防ぐために、不浸透性の障壁としてだけでなく、保護するための最初の防衛線として機能するだけでなく、を介して基礎となる真皮に接続重層上皮であります外国と有害物質1から体。表皮の最も深い層である基底層は、表皮2の残りの部分を形成する分化した子孫を生じさせる上皮幹細胞および前駆細胞が含まれています。上皮前駆細胞が分化するように、それらは有棘層3として知られている分化した細胞の第1の層を形成するために上方に移動します。棘層では、細胞は、その後、表皮の分化した層のための物理的ストレスに耐える強度を提供する、ケラチン1および10の発現をオンにします。有棘層細胞は、さらに分化するように、それらはのために、表皮中で上方に移動ケラトヒアリンおよびラメラ顆粒の形成と同様に、原形質膜の下に組み立てられている構造タンパク質によって特徴付けられる顆粒層をメートル。細胞は、分化過程に進むように、ラメラ顆粒が細胞から押し出されているが、原形質膜の下のタンパク質は、クロス脂質豊富な障壁を形成するように互いに連結された角質層4と呼ばれます 。
上皮細胞の増殖および分化への影響の変化を伴う疾患人口の5〜20％。したがって、このプロセスのメカニズムを理解することは非常に重要です。これらの疾患の多くの症状は、細胞-細胞または細胞-マトリックス接触時に偶発的であることから、ヒトの表皮は、3D環境で再構成された器官培養物は、6月10日に作成されています。これらの方法は、典型的には、失活ヒトなどの細胞外マトリックス上に播種し、一次または形質転換ケラチノサイトの使用を含みます真皮、マトリゲル、またはコラーゲン。
上皮細胞の増殖および分化において重要な遺伝子調節機構を理解するために、ケラチノサイトを遺伝的に、2D培養での遺伝子ノックダウンまたは過剰発現するようにレトロウイルスベクターを介して操作され、その後、3次元で再構成することができます。これらの方法は、新生物11-21に表皮幹細胞および前駆細胞の自己再生および分化ならびに進行に関与する遺伝子を特徴づけるために広く使用されています。ここでは、レトロウイルスの使用を介して表皮器官培養物中の遺伝子発現を変化させる方法についての詳細なプロトコルが提供されます。
Protocol
Representative Results
Discussion
ヒト皮膚器官培養における遺伝子操作は、一般的に、2D培養細胞だけでなく、マウスモデルを研究するために多くの利点を提供します。 2D培養物は、無傷の組織および器官に見出される三次元の細胞 – 細胞および細胞 – 細胞外マトリックス相互作用を欠いています。最近の研究では、一次ヒト皮膚腫瘍16にはるかに遺伝子発現の類似性を示す3次元培養細胞を用いた2次元および3次元培?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、米国癌協会の研究学者グラント（RSG-12-148-01-DDC）とCIRM基本生物学賞（RB4-05779）supportedbyました。
Materials
| Human skin | New York Firefighters Skin Bank | http://www.cornellsurgery.org/pro/services/burn-surgery/skin-bank.html |
| PEN/STREP | GIBCO | 15140-122 |
| amphotropic phoenix cell lines | ATCC | CRL-3213 |
| FUGENE 6 transfection reagent | Promega | E2691 |
| Keratinocyte Media (KCSFM) | Life Technologies | 17005042 |
| DMEM | GIBCO | 11995 |
| Ham's F12 | Cambrex | 12-615F |
| FBS | GIBCO | 10437-028 |
| Adenine | Sigma | A-9795 |
| Cholera Toxin | Sigma | C-8052 |
| Hydrocortisone | Calbiochem | 3896 |
| Insulin | Sigma | I-1882 |
| EGF | Invitrogen | 13247-051 |
| Transferrin | Sigma | T-0665 |
| Ciprofloxacin Hydrochloride | Serologicals | 89-001-1 |
| cautery | Bovie Medical Corporation | AA01 |
| Matrigel | Corning | 354234 |
| Keratin 1 antibody | Biolegend | PRB-149P |
| square pegs | Arts and crafts stores | |
| human neonatal keratinocytes | ATCC | PCS-200-010 |
| human neonatal keratinocytes | Cell Applications | 102K-05n |
| MSCV retroviral vector | Clontech | 634401 |
| LZRS retroviral vector | Addgene | |
| pSuper.Retro.Puro Retroviral vector | Oligoengine | VEC-PRT-0002 |
| hexadimethrine bromide | Sigma | H9268-5G |
References
- Tadeu, A. M., Horsley, V. Epithelial stem cells in adult skin. Current topics in developmental biology. 107, 107-131 (2014).
- Sen, G. L. Remembering one’s identity: the epigenetic basis of stem cell fate decisions. FASEB J. 25, 2123-2128 (2011).
- Segre, J. A. Epidermal barrier formation and recovery in skin disorders. J Clin Invest. 116, 1150-1158 (2006).
- Eckert, R. L., Sturniolo, M. T., Broome, A. M., Ruse, M., Rorke, E. A. Transglutaminase function in epidermis. J Invest Dermatol. 124, 481-492 (2005).
- Lopez-Pajares, V., Yan, K., Zarnegar, B. J., Jameson, K. L., Khavari, P. A. Genetic pathways in disorders of epidermal differentiation. Trends Genet. 29, 31-40 (2013).
- Fuchs, E. Epidermal differentiation: the bare essentials. J Cell Biol. 111, 2807-2814 (1990).
- Green, H., Kehinde, O., Thomas, J. Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting. Proc Natl Acad Sci U S A. 76, 5665-5668 (1979).
- Khavari, P. A. Modelling cancer in human skin tissue. Nat Rev Cancer. 6, 270-280 (2006).
- Parenteau, N. L., Bilbo, P., Nolte, C. J., Mason, V. S., Rosenberg, M. The organotypic culture of human skin keratinocytes and fibroblasts to achieve form and function. Cytotechnology. 9, 163-171 (1992).
- Oh, J. W., Hsi, T. C., Guerrero-Juarez, C. F., Ramos, R., Plikus, M. V. Organotypic skin culture. J Invest Dermatol. 133, e14 (2013).
- Sen, G. L., et al. ZNF750 Is a p63 Target Gene that Induces KLF4 to Drive Terminal Epidermal Differentiation. Dev Cell. 22, 669-677 (2012).
- Sen, G. L., Webster, D. E., Barragan, D. I., Chang, H. Y., Khavari, P. A. Control of differentiation in a self-renewing mammalian tissue by the histone demethylase JMJD3. Genes Dev. 22, 1865-1870 (2008).
- Mistry, D. S., Chen, Y., Wang, Y., Zhang, K., Sen, G. L. SNAI2 controls the undifferentiated state of human epidermal progenitor cells. Stem Cells. 32, 3209-3218 (2014).
- Truong, A. B., Kretz, M., Ridky, T. W., Kimmel, R., Khavari, P. A. p63 regulates proliferation and differentiation of developmentally mature keratinocytes. Genes Dev. 20, 3185-3197 (2006).
- Kretz, M., et al. Control of somatic tissue differentiation by the long non-coding RNA TINCR. Nature. 493, 231-235 (2013).
- Ridky, T. W., Chow, J. M., Wong, D. J., Khavari, P. A. Invasive three-dimensional organotypic neoplasia from multiple normal human epithelia. Nat Med. 16, 1450-1455 (2010).
- Mistry, D. S., Chen, Y., Sen, G. L. Progenitor function in self-renewing human epidermis is maintained by the exosome. Cell Stem Cell. 11, 127-135 (2012).
- Kretz, M., et al. Suppression of progenitor differentiation requires the long noncoding RNA ANCR. Genes Dev. 26, 338-343 (2012).
- Mulder, K. W., et al. Diverse epigenetic strategies interact to control epidermal differentiation. Nat Cell Biol. 14, 753-763 (2012).
- Boxer, L. D., Barajas, B., Tao, S., Zhang, J., Khavari, P. A. ZNF750 interacts with KLF4 and RCOR1, KDM1A, and CTBP1/2 chromatin regulators to repress epidermal progenitor genes and induce differentiation genes. Genes Dev. 28, 2013-2026 (2014).
- Jameson, K. L., et al. IQGAP1 scaffold-kinase interaction blockade selectively targets RAS-MAP kinase-driven tumors. Nat Med. 19, 626-630 (2013).
- Mistry, D. S., Chen, Y., Wang, Y., Sen, G. L. Transcriptional profiling of SNAI2 regulated genes in primary human keratinocytes. Genomics data. 4, 43-46 (2015).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
- Doebis, C., et al. Efficient in vitro transduction of epithelial cells and keratinocytes with improved adenoviral gene transfer for the application in skin tissue engineering. Transpl immunol. 9, 323-329 (2002).
- Melo, S. P., et al. Somatic correction of junctional epidermolysis bullosa by a highly recombinogenic AAV variant. Mol Ther. 22, 725-733 (2014).
- Nanba, D., Matsushita, N., Toki, F., Higashiyama, S. Efficient expansion of human keratinocyte stem/progenitor cells carrying a transgene with lentiviral vector. Stem cell res ther. 4, 127 (2013).
- Sen, G. L., Reuter, J. A., Webster, D. E., Zhu, L., Khavari, P. A. DNMT1 maintains progenitor function in self-renewing somatic tissue. Nature. 463, 563-567 (2010).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 647-664 (2014).
- Krejci, N. C., Cuono, C. B., Langdon, R. C., McGuire, J. In vitro reconstitution of skin: fibroblasts facilitate keratinocyte growth and differentiation on acellular reticular dermis. J Invest Dermatol. 97, 843-848 (1991).
- Mathes, S. H., Ruffner, H., Graf-Hausner, U. The use of skin models in drug development. Adv Drug Deliv Rev. 69-70, 81-102 (2014).
