En Endotelial Planar Cell Modell for Imaging Immunologisk Synapse Dynamics
Summary
Adaptive immunity is controlled by dynamic ‘immunological synapses’ formed between T cells and antigen presenting cells. This protocol describes methods for investigating endothelial cells both as understudied physiologic APCs and as a novel type of ‘planar cellular APC model’.
Abstract
Adaptiv immunitet er regulert av dynamisk interaksjon mellom T-celler og antigenpresenterende celler ("APC") referert til som "immunologiske synapser '. Innenfor disse intime celle-celle grensesnitt diskrete sub-cellulære klynger av MHC / Ag-TCR, F-aktin, heft og signalmolekyler danner og fornye seg raskt. Disse dynamikk er antatt å være kritiske faktorer som bestemmer både effektiviteten og kvaliteten av immunresponser som utvikler og derfor av beskyttende versus patologiske immunitet. Nåværende forståelse av immunologiske synapser med fysiologisk APC er begrenset av utilstrekkeligheten av den oppnåelige bildeoppløsning. Selv kunstige underlaget modeller (f.eks planar lipidbilag) tilbyr utmerket oppløsning og har vært svært verdifullt verktøy, de er iboende ikke-fysiologiske og unyansert. Vaskulære og lymfatiske endotelceller har dukket opp som en viktig perifert vev (eller stromal) rommet i "semi-profesjonal APC '. Disse APC (som uttrykker mest av den molekylære maskineri av profesjonelle APC) har den unike egenskap til å danne nesten plane celleoverflaten og er lett transfectable (f.eks med fluorescerende protein journalister). Heri en grunnleggende metode for å implementere endotelceller som en ny og fysiologisk 'plane cellulær APC modell "for forbedret avbildning og utspørring av grunnleggende antigene signaleringsprosessene vil bli beskrevet.
Introduction
T-lymfocytter er en gren av det adaptive immunsystemet, karakterisert ved evnen til effektivt å gjenkjenne peptid antigen (Ag) bundet til hovedhistokompatibilitetskompleks (MHC) molekyler gjennom deres T-celle-reseptorer (TCR) 1. Naive lymfocytter konstitutivt migrere og skanne faglige Ag celler '(APC, for eksempel, dendrittiske celler) i lymfeknuter, mens minne / effektor T-celler trenger for å effektivt kartlegge et ekstremt bredt spekter av APC og potensielle målceller i perifere vev.
I min etter første gangs registrering av beslektet Ag på en APC, lymfocytter arrestere deres migrasjon og begynner å danne en spesialisert intim celle-celle-grensesnitt kalles 'immunologiske synapsen "(IS). Vedvarende (dvs. 30-60 min) ER kontakter er nødvendig for å forsterke og opprettholde signale 2-7. Emerging studier identifisere at innenfor IS, er det kontinuerlig dannelse og rask remodeling av diskrete sub-cellulære signalmikro klynger (dvs. inneholder MHC / Ag-TCR, F-aktin, heft og signalmolekyler) som bestemmer styrken og kvaliteten på resulterende immunresponser 2-7. Imidlertid er dynamiske detaljer og reguleringsmekanisme av denne prosessen ufullstendig forstått 8,9. Dette stammer i stor grad fra tekniske utfordringer knyttet til uregelmessige topologier av APC flater og dårlig kontrollert orientering av celle-celle interaksjons fly, problemer som dypt begrenser den nødvendige tid og rom bildebehandling nærmer 8-10 (Figure1A).
Figur 1. En fysiologisk Planar Cell APC Modell for Imaging Immunologisk Synapse Dynamics. Den skjematisk illustrerer tradisjonelle avbildning av immunologisk synapse mellom en T-celle og en professio nal APC (A) og T-celle og en tradisjonell plan lipidbilag APC modellen (B) i forhold til denne nye endotelial plane APC-modellen (C). Profesjonelle APC tilveiebringe fysiologiske immunologiske synapser men har dårlig orientert celle-celle grensesnitt (dvs. med hensyn til den optimale xy avbildningsplanet; oppløsning ~ 0,2 mikrometer), noe som dramatisk kompromisser romlig (z avbildningsplanet oppløsning ~ 1 um) og tidsmessig (dvs. på grunn av behovet for å gjentatte ganger søke gjennom alle z avbildningsplan) oppløsning av bildebehandling. Bilags modeller har en plan topologi som gir optimal spatiotemporal bildeoppløsning, men er også svært forenklet, ikke-fysiologiske og rigid. Dette endotelceller modellen kombinerer planar topologien lipidbilag med fysiologisk substrat av en klassisk APC å levere optimal romlig og tidsmessig bildeoppløsning i en fysiologisk setting.m / filer / ftp_upload / 53288 / 53288fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tidligere arbeid har delvis omgå disse hindringene ved å utvikle plant substrat modeller (dvs. lipidbilag og antistoff-belagte overflater) som gir optimal tid og rom-oppløsning (dvs. via fiksering av T-celleaktivering overflaten til et enkelt plan som er parallelt til den optimale xy avbildnings planet) 11-15 (figur 1B). Disse modellene har tilrettelagt viktig innsikt i de subcellulære / molekylær dynamikk som styrer antigen signale i T-celler, inkludert oppdagelsen av dynamisk aktin / TCR signal mikro-klynger 7,11-14. Imidlertid er slike modeller iboende kles, samt stiv (utelukker utviklingen / studiet av tre-dimensjonale topologiske egenskaper) (figur 1B). Derfor er det fortsatt usikkert hvordan å fortelle om slike funn til grafisiologic celle-celle immunovervåkning.
Men fortsatt studerte, er vaskulære og lymfatiske endotelceller fremstår som en stor (dvs. større i antall enn alle profesjonelle APC, ved ~ 1000 ganger) perifer rommet i "semi-profesjonelle 'APC 16-18. Disse cellene uttrykker MHC-I-, MHC-II- og et mangfold av co-stimulatorer molekyler (f.eks CD40, LFA3, ICOSL, 4-1BB, OX40L, TL1A, PD-L1, men ikke CD80 og CD86) og er strategisk plassert på blod-vev grensesnitt der de tjener spesialiserte sentinel funksjoner 16-18. Tidligere studier har vist at endotelcellene effektivt kan gjen stimulere effektor / minne, men ikke naive, T-celler 19-25. Således endotelceller vil kunne spille unike APC roller i effektorfasen adaptive immunresponser i de perifere vev, slik som lokale innflytelse på T-celleaktivering, differensiering, hukommelse og toleranse 16,17,26. Critisk, når dyrket in vitro, endotelceller danner praktisk talt plane celleoverflater og er lett transfectable (f.eks, med fluorescerende protein reportere). Disse funksjonene er ideelle for høy spatiotemporal oppløsning avbildning av topologiske dynamikk i celle-celle interaksjoner 19,27. Dermed endotelceller kan tjene som en fysiologisk 'planar cellular APC' modell utpreget egnet for studiet av subcellulære / molekylær ombygging mekanismer som driver antigen anerkjennelse og regulerer svar (figur 1C) 19,20.
Tidligere etablert komplementære billedteknikker (inkludert transfeksjon av endothelia cellene med fluorescente protein produsentene av plasmamembranen og cytosol) for å studere detaljene for leukocytt-endotelial interaksjon under adhesjon og transendothelial migrering 27, viste at leukocytter sonde aktivt overflaten av endotel ved dynamisk innsetting end tilbaketrekking av sub-mikron-skala, actin-rik sylindriske fremspring (~ 200-1000 nm i diameter og dybde) betegnes invadosome lignende fremspring (dvs. 'ILPs') 27,28. Disse avbildnings tilnærminger har blitt ytterligere utvidet sammen med etableringen av protokoller for å dra nytte av endotelial APC-funksjon til å utvikle det første metoder for høy spatiotemporal oppløsning avbildning av T-celle-endotelial immunologiske synapse som rapportert 19,20 og beskriver videre heri. Et sentralt funn som stammer fra denne romanen planar mobil APC-modellen er at T-celle ILPs fungere både i å fremme innledende Ag deteksjon og i å opprettholde påfølgende signalering. Faktisk, matriser av flere ILPs (som ble stabilisert og påløpt i respons til innledende kalsium flux) viser berikelse i TCR og molekyler som tyder på aktiv signal slik PKC-Q, ZAP-70, fosfotyrosin og HS1. Derfor ILPs synes å representere en tredimensjonal fysiologisk ekvivalent med den TCR-signalisering mikroklynger sett i planar bilags modeller. Denne tilnærmingen, og dermed avslører følsomt / rapporter molekylære og arkitektoniske (og implisitte biomekaniske) dynamikk ellers ikke synlig.
Metoden er beskrevet i dette dokumentet skal være nyttig for å bygge bro over gapet mellom profesjonell APC og kunstige APC substrat modeller for å styrke vår evne til å avhøre grunnleggende mekanismer for adaptive immunresponser. Mens her gjelder det på aktivering av CD4 + Th1-type effektor / minnecelle, kan denne grunnleggende metode kan lett modifiseres for å studere et bredt spekter av T-celletyper og Ags, som diskutert nedenfor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Samlet sett beskriver denne protokollen metoder for å undersøke endotelceller som i) studerte fysiologiske APC og ii) som en ny type 'plane cellular APC-modellen ". Med hensyn til tidligere, har det blitt stadig mer verdsatt at ikke-blodkreft perifere (eller 'stromal') APC spiller avgjørende, ikke-redundante roller (dvs., sammenlignet med blodkreft APC) i utformingen adaptive immunresponser 16-18. Blant slike "semi-profesjonelle 'APC, vaskulær og lymfatiske endotelceller…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Peter T. Sage for his assistance in generating some of the representative images. This work was supported by an NIH R01 grant to C.V.C. (HL104006).
Materials
| BD Vacutainer stretch latex free tourniquet | BD Biosciences | 367203 | |
| BD alcohol swabs | BD Biosciences | 326895 | |
| BD Vacutainer Safety-Lok | BD Biosciences | 367861 | K2 EDTA |
| BD Vacutainer Push Button Blood Collection Set | BD Biosciences | 367335 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R8758-1L | |
| Ficoll-Paque | Sigma-Aldrich | GE17-1440-02 | Bring to RT before use |
| FCS-Optima | Atlanta Biologics | s12450 | Heat inactivated |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458-100ML | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | |
| staphylococcal enterotoxin B | Toxin Technology | BT202RED | Stock solution 1mg/ml in PBS |
| toxic shock syndrome toxin 1 | Toxin Technology | TT606RED | Stock solution 1mg/ml in PBS |
| human IL-15 | R&D Systems | 247-IL-025 | Stock solution 50ug/ml in PBS |
| PBS | Life Technologies | 10010-049 | |
| Fibronectin | Life Technologies | 33016-015 | Stock solution 1mg/ml in H20 |
| HMVEC-d Ad-Dermal MV Endo Cells | Lonza | CC-2543 | Other Human Microvascular ECs can be used, i.e. HLMVECs |
| EGM-2 MV bullet kit | Lonza | CC-3202 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T-4174 | Stock solution 10x, dilute in PBS |
| amaxa-HMVEC-L Nucleofector Kit | Lonza | vpb1003 | Required Kit for step 4 |
| IFN-g | Sigma-Aldrich | I3265 | Stock solution 1mg/ml in H20 |
| TNF-alpha 10ug, human | Life Technologies | PHC3015 | Stock solution 1mg/ml in H20 |
| phenol Red-free HBSS | Life Technologies | 14175-103 | |
| Hepes | Fisher Scientific | BP299-100 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016-100G | Stock solution 1M in H20 |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 208337 | Stock solution 1M in H20 |
| Human Serum albumin | Sigma-Aldrich | A6909-10ml | |
| Immersol 518 F fluorescence free Immersion oil | Fisher Scientific | 12-624-66A | |
| Fura-2 AM 20x50ug | Life Technologies | F1221 | Stock solution 1mM in DMSO |
| pEYFP-Mem (Mem-YFP) | Clontech | 6917-1 | |
| pDsRed-Monomer (Soluble Cytoplasmic DsRed) | Clontech | 632466 | |
| pDsRed-Monomer Membrane (Mem-DsRed) | Clontech | 632512 | |
| pEGFP-Actin | Clontech | 6116-1 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Life Technologies | A12379 | |
| Formaldehyde solution 37% | Fisher Scientific | BP531-500 | Toxic, use fumehood |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-5ML | |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| Falcon Tissue Culture Treated Flasks T25 | Fisher Scientific | 10-126-9 | |
| Falcon Tissue Culture Treated Flasks T75 | Fisher Scientific | 13-680-65 | |
| Corning Cell Culture Treated T175 | Fisher Scientific | 10-126-61 | |
| Glass coverslips | Fisher Scientific | 12-545-85 | 12 mm diameter |
| Falcon Tissue Culture Plates 24-well | Fisher Scientific | 08-772-1 | |
| Delta-T plates | Bioptechs | 04200415B | |
| Wheaton Disposable Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-8D | |
| 1.5 ml Eppendorf tube | Fisher Scientific | 05-402-25 | |
| ICAM1 mouse anti-human | BD Biosciences | 555509 | |
| HS1 mouse anti-human | BD Biosciences | 610541 | |
| Anti-Human CD11a (LFA-1alpha) Purified | ebioscience | BMS102 | |
| Anti-Human CD3 Alexa Fluor® 488 | ebioscience | 53-0037-41 | |
| Anti-MHC Class II antibody | Abcam | ab55152 | |
| Anti-Talin 1 antibody | Abcam | ab71333 | |
| Anti-PKC theta antibody | Abcam | ab109481 | |
| phosphotyrosine (4G10 Platinum) | Millipore | 50-171-463 | |
| Nucleofector II | Amaxa Biosystems | Required electroporator for step 4 | |
| Zeiss Axiovert | Carl Zeiss MicroImaging | ||
| Zeiss LSM510 | Carl Zeiss MicroImaging | ||
| Zeiss Axiovison Software | Carl Zeiss MicroImaging | ||
| NU-425 (Series 60) Biological Safety Cabinet | NuAIRE | Nu-425-600 | |
| Forma STRCYCLE 37 °C, 5% CO2 Cell culture Incubator | Fisher Scientific | 202370 | |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | EW-02570-02 | |
| Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | Bright-Line Hemocytometer |
| Isotemp Waterbath model 202 | Fisher Scientific | 15-462-2 |
References
- von Andrian, U. H., Mackay, C. R. T-cell function and migration. Two sides of the same coin. N. Engl. J. Med. 343 (14), 1020-1034 (2000).
- Springer, T. A. Adhesion receptors of the immune system. Nature. 346 (6283), 425-434 (1990).
- Shaw, A. S., Dustin, M. L. Making the T cell receptor go the distance: a topological view of T cell activation. Immunity. 6 (4), 361-369 (1997).
- Monks, C. R., Freiberg, B. A., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).
- Delon, J., Stoll, S., Germain, R. N. Imaging of T-cell interactions with antigen presenting cells in culture and in intact lymphoid tissue. Immunol Rev. 189, 51-63 (2002).
- Brossard, C., et al. Multifocal structure of the T cell – dendritic cell synapse. Eur J Immunol. 35 (6), 1741-1753 (2005).
- Dustin, M. L. The cellular context of T cell signaling. Immunity. 30 (4), 482-492 (2009).
- Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action. Nat Rev Immunol. 11 (1), 21-33 (2011).
- Cebecauer, M., Spitaler, M., Serge, A., Magee, A. I. Signalling complexes and clusters: functional advantages and methodological hurdles. J Cell Sci. 123, 309-320 (2010).
- Oddos, S., et al. High-speed high-resolution imaging of intercellular immune synapses using optical tweezers. Biophys J. 95 (10), L66-L68 (2008).
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
- Bunnell, S. C., et al. T cell receptor ligation induces the formation of dynamically regulated signaling assemblies. J Cell Biol. 158 (7), 1263-1275 (2002).
- Yokosuka, T., et al. Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76. Nat Immunol. 6 (12), 1253-1262 (2005).
- Seminario, M. C., Bunnell, S. C. Signal initiation in T-cell receptor microclusters. Immunol Rev. 221, 90-106 (2008).
- Dustin, M. L. Supported bilayers at the vanguard of immune cell activation studies. J Struct Biol. 168 (1), 152-160 (2009).
- Martinelli, R., Carman, C. V., Bradshaw, R. A., Stahl, P. Lymphocyte Endothelilal Interactions. Encyclopedia of Cell Biology. , (2015).
- Choi, J., Enis, D. R., Koh, K. P., Shiao, S. L., Pober, J. S. T lymphocyte-endothelial cell interactions. Annu Rev Immunol. 22, 683-709 (2004).
- Marelli-Berg, F. M., Jarmin, S. J. Antigen presentation by the endothelium: a green light for antigen-specific T cell trafficking?. Immunol Lett. 93 (2-3), 109-113 (2004).
- Sage, P. T., et al. Antigen recognition is facilitated by invadosome-like protrusions formed by memory/effector T cells. J Immunol. 188 (8), 3686-3699 (2012).
- Kumari, S., et al. Actin foci facilitate activation of the phospholipase C-gama in primary T lymphocytes via the WASP pathway . eLife. , (2015).
- Marelli-Berg, F. M., et al. Major histocompatibility complex class II-expressing endothelial cells induce allospecific nonresponsiveness in naive T cells. J Exp Med. 183 (4), 1603-1612 (1996).
- Ma, W., Pober, J. S. Human endothelial cells effectively costimulate cytokine production by, but not differentiation of, naive CD4+ T cells. J Immunol. 161 (5), 2158-2167 (1998).
- Perez, V. L., Henault, L., Lichtman, A. H. Endothelial antigen presentation: stimulation of previously activated but not naive TCR-transgenic mouse T cells. Cell Immunol. 189 (1), 31-40 (1998).
- Epperson, D. E., Pober, J. S. Antigen-presenting function of human endothelial cells. Direct activation of resting CD8 T cells. J Immunol. 153 (12), 5402-5412 (1994).
- Shiao, S. L., et al. Human effector memory CD4+ T cells directly recognize allogeneic endothelial cells in vitro and in vivo. J Immunol. 179 (7), 4397-4404 (2007).
- Marelli-Berg, F. M., Okkenhaug, K., Mirenda, V. A two-signal model for T cell trafficking. Trends Immunol. 28 (6), 267-273 (2007).
- Carman, C. V., et al. Transcellular diapedesis is initiated by invasive podosomes. Immunity. 26 (6), 784-797 (2007).
- Carman, C. V. Mechanisms for transcellular diapedesis: probing and pathfinding by ‘invadosome-like protrusions’. J Cell Sci. 122 ((Pt 17)), 3025-3035 (2009).
- Dustin, M. L., Tseng, S. Y., Varma, R., Campi, G. T. T cell-dendritic cell immunological synapses. Curr Opin Immunol. 18 (4), 512-516 (2006).
- Saito, T., Yokosuka, T. Immunological synapse and microclusters: the site for recognition and activation of T cells. Curr Opin Immunol. 18 (3), 305-313 (2006).
- Gomez, T. S., et al. HS1 functions as an essential actin-regulatory adaptor protein at the immune synapse. Immunity. 24 (6), 741-752 (2006).
- Burbach, B. J., Medeiros, R. B., Mueller, K. L., Shimizu, Y. T-cell receptor signaling to integrins. Immunol Rev. 218, 65-81 (2007).
- Vicente-Manzanares, M., Sanchez-Madrid, F. Role of the cytoskeleton during leukocyte responses. Nat Rev Immunol. 4 (2), 110-122 (2004).
- Ma, Z., Janmey, P. A., Finkel, T. H. The receptor deformation model of TCR triggering. Faseb J. 22 (4), 1002-1008 (2008).
- Ma, Z., Sharp, K. A., Janmey, P. A., Finkel, T. H. Surface-anchored monomeric agonist pMHCs alone trigger TCR with high sensitivity. PLoS Biol. 6 (2), e43 (2008).
- Groves, J. T. Bending mechanics and molecular organization in biological membranes. Annu Rev Phys Chem. 58, 697-717 (2007).
- Xu, C., et al. Regulation of T cell receptor activation by dynamic membrane binding of the CD3epsilon cytoplasmic tyrosine-based motif. Cell. 135 (4), 702-713 (2008).
