العزلة الفيروسية النسخ المتماثل حجرة التخصيب النووي الكسور الفرعية من اتش المصابة الخلايا الطبيعية الإنسان
Summary
We provide a novel strategy to isolate viral replication compartments (RC) from adenovirus (Ad)-infected human cells. This approach represents a cell-free system that can help to elucidate the molecular mechanisms regulating viral genome replication and expression as well as regulation of viral-host interactions established at the RC.
Abstract
During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments through the recruitment of viral and cellular proteins to sites occupied by the viral genome. These sites, called replication compartments (RC), can be considered viral-induced nuclear domains where the viral genome is localized and viral and cellular proteins that participate in replication, transcription and post-transcriptional processing are recruited. Moreover, cellular proteins involved in the antiviral response, such as tumor suppressor proteins, DNA damage response (DDR) components and innate immune response factors are also co-opted to RC. Although RC seem to play a crucial role to promote an efficient and productive replication cycle, a detailed analysis of their composition and associated activities has not been made. To facilitate the study of adenoviral RC and potentially those from other DNA viruses that replicate in the cell nucleus, we adapted a simple procedure based on velocity gradients to isolate Ad RC and established a cell-free system amenable to conduct morphological, functional and compositional studies of these virus-induced subnuclear structures, as well as to study their impact on host-cell interactions.
Introduction
الغدية تحتوي على جينوم الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل أن يعيد في نواة الخلية المصابة. عندما يدخل الحمض النووي الفيروسي النواة، فإنه يموضع المجاور للهيئات النووية PML 1. بعد الفيروسي التعبير الجيني المبكر، وإعادة تنظيم الهيكل النووية بشكل كبير، الأمر الذي أدى تشكيل microenvironments الفيروسية، ووصف المقصورات تكاثر الفيروس (RC) 2. منذ اتش (الإعلان) RC من المواقع حيث تكرار الجينوم الفيروسي والتعبير عن الجينات الفيروسية أواخر تأخذ مكان، لأنها توفر بيئة ملائمة لتوظيف جميع العوامل الفيروسية والخلوية اللازمة التي تشارك في هذه العمليات. ومن المثير للاهتمام، ومجموعة متنوعة من البروتينات الخلوية المسؤولة عن الاستجابة المضادة للفيروسات الخلوية، مثل استجابة الحمض النووي من التلف، والاستجابة المناعية الفطرية وقمع الورم هي تحييدهم لهذه المواقع الفيروسية 2. وبالتالي، يمكن اعتبار الإعلان RC المحاور التنظيمية التي تعزز تكاثر الفيروس الفعال في حين تنظم بالتزامن فياستجابة المضادة للفيروسات الخلوية، مشيرا إلى أن هذه الهياكل هي المفتاح لفهم الفيروس في استضافة التفاعلات الخلية. ومع ذلك، فإن الآليات الجزيئية لتشكيل RC، وغير مفهومة تكوينها والأنشطة المرتبطة بها.
الفيروسة الغدانية RC، وكذلك RC من الفيروسات DNA الأخرى التي تحاكي في النواة لا ترتبط إلى الأغشية، وعلى النقيض من RC حشوية 3. وعلاوة على ذلك، من المرجح أن تكون مؤلفة بالكامل من البروتينات والأحماض النووية هذه الهياكل التي يسببها الفيروس. RC تشكلت في الخلايا المصابة بفيروسات RNA (عادة ما تسمى المصانع الفيروسية) تم عزلها، والاستفادة من توطين حشوية ومركزهم بغشاء، والتي سهلت الصرفية الخاصة بهم تفصيلا، وظيفية والكيمياء الحيوية توصيف 4.
على حد علمنا، الفيروسي RC النووي لم يتم عزلها، وربما يرجع ذلك إلى تعقيد الهندسة المعمارية النووية وغياب متر داخل النواةembranes التي من شأنها تسهيل عزلتهم. وقد اعتمدت الدراسة بدلا من ذلك على الفحص المجهري المناعي، FISH وانتقال المجهر الإلكتروني. ومع ذلك، على الرغم من التعقيدات الملازمة لعزل المنشآت النووية الدقيقة المجالات النووية الأخرى مثل نويات والهيئات كاجال تم عزلها قبل 5،6. منذ الأنوية وRC كلاهما يتألف من البروتينات والأحماض النووية، ويكون قطرها بين 0،5-5 ميكرون، ونحن افترضنا أن RC ينبغي أيضا أن تكون قابلة للعزل. ولذلك، من أجل توصيف أكثر دقة التركيب الجزيئي وظائف المرتبطة RC، أنشأنا طريقة جديدة لعزل كسور النووية الدقيقة المخصب مع RC. تحقيقا لهذه الغاية، ونحن على استعداد الكسور شبه النووي باستخدام تدرجات السرعة وسائد السكروز مماثلة إلى الإجراءات المستخدمة لعزل نويات 7 أو المجالات النووية الأخرى 6، وأنشأ نظام خالية من الخلايا التي تسمح للدراسة التركيب الجزيئي والأنشطة المرتبطة بهاRC. ولذلك ينبغي أن هذه التقنية تقدم فهم الفيروس في استضافة التفاعلات الخلية ويمثل أداة قوية التي ينبغي أيضا تسهيل تحليل مفصل لRC من الفيروسات الأخرى التي تحاكي في النواة ولحث على تشكيل حجرات تكرار أبعاد مماثلة لتلك التي تشكلت في adenovirus- الخلايا المصابة، مثل فيروس الهربس، الورم الحلمي أو polyomaviruses.
Protocol
Representative Results
Discussion
In order to elucidate the molecular mechanisms that govern regulation of cellular activities by viral infection understanding the composition and activities associated with RC would be instrumental. Therefore, to make a detailed analysis of RC, we established a cell-free system that takes advantage of the size and biochemical composition of these virus-induced structures, to isolate subnuclear fractions enriched with RC using a simple procedure that relies on velocity gradients with sucrose cushions. Critical steps of th…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from CONACyT-SEP (SEP-2008-84582; CB-2011-01-168497) and Promep-SEP for R.A.G.; P.H. received a scholarship from CONACyT (447442).
Materials
| DMEM | Gibco | 12100-046 | Warm in 37 ºC water bath before use |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 12484-028 | |
| Sucrose, Ultra Pure | Research Organics | 0928S | Prepare a 2.55 M stock solution and store at 4 ºC |
| Dounce homogenizer | Kontess Glass Company | 884900-0000 | |
| Branson 1800 Ultrasonic Bath | Branson | Z769533 SIGMA | Turn on 15 min before use. |
| Peroxidase AffiniPure F(ab')₂ Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-036-003 | Use at a 1:10,000 dilution in PBS/0.03% non-fat milk |
| Goat anti-Mouse IgG1 Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-21121 | Use at a 1:2,000 dilution in PBS |
| Silane-Prep Slides | Sigma | S4651-72EA | Open in a laminar flow cabinet |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Pierce ThermoScientific | 34080 |
References
- Doucas, V., et al. Adenovirus replication is coupled with the dynamic properties of the PML nuclear structure. Genes & Dev. 10, 196-207 (1996).
- Schmid, M., Speiseder, T., Dobner, T., Gonzalez, R. A. DNA virus replication compartments. J. Virol. 88, 1404-1420 (2014).
- Boon, J. A., Diaz, A., Ahlquist, P. Cytoplasmic viral replication complexes. Cell host microbe. 8, 77-85 (2010).
- Paul, D., Hoppe, S., Saher, G., Krijnse-Locker, J., Bartenschlager, R. Morphological and biochemical characterization of the membranous hepatitis C virus replication compartment. J. Virol. 87, 10612-10627 (2013).
- Busch, H., et al. Isolation of Nucleoli. Exp Cell Res. 24, 150-163 (1963).
- Lam, Y. W., Lyon, C. E., Lamond, A. I. Large-scale isolation of Cajal bodies from HeLa cells. Mol. Biol. Cell. 13, 2461-2473 (2002).
- Lam, Y. W., Trinkle-Mulcahy, L., Lamond, A. I. The nucleolus. J Cell Sci. 118, 1335-1337 (2005).
- Groitl, P., Dobner, T. Construction of adenovirus type 5 early region 1 and 4 virus mutants. Methods Mol Med. 130, 29-39 (2007).
- Reich, N. C., Sarnow, P., Duprey, E., Levine, A. J. Monoclonal antibodies which recognize native and denatured forms of the adenovirus DNA-binding protein. Virology. 128, 480-484 (1983).
- Leppard, K. N. Selective effects on adenovirus late gene expression of deleting the E1b 55K protein. J Gen Virol. 74 (Pt 4), 575-582 (1993).
- Gonzalez, R., Huang, W., Finnen, R., Bragg, C., Flint, S. J. Adenovirus E1B 55-kilodalton protein is required for both regulation of mRNA export and efficient entry into the late phase of infection in normal human fibroblasts. J. Virol. 80, 964-974 (2006).
- Castillo-Villanueva, E., et al. The Mre11 Cellular Protein Is Modified by Conjugation of Both SUMO-1 and SUMO-2/3 during Adenovirus Infection. ISRN Virology. 2014, 14 (2014).
- Morris, S. J., Scott, G. E., Leppard, K. N. Adenovirus late-phase infection is controlled by a novel L4 promoter. J. Virol. 84, 7096-7104 (2010).
- Wright, J., Leppard, K. N. The human adenovirus 5 L4 promoter is activated by cellular stress response protein p53. J. Virol. 87, 11617-11625 (2013).
