Выделение вирусной репликации отсек обогащенных субъядерных фракций из аденовируса-инфицированных клетках человека нормальный
Summary
We provide a novel strategy to isolate viral replication compartments (RC) from adenovirus (Ad)-infected human cells. This approach represents a cell-free system that can help to elucidate the molecular mechanisms regulating viral genome replication and expression as well as regulation of viral-host interactions established at the RC.
Abstract
During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments through the recruitment of viral and cellular proteins to sites occupied by the viral genome. These sites, called replication compartments (RC), can be considered viral-induced nuclear domains where the viral genome is localized and viral and cellular proteins that participate in replication, transcription and post-transcriptional processing are recruited. Moreover, cellular proteins involved in the antiviral response, such as tumor suppressor proteins, DNA damage response (DDR) components and innate immune response factors are also co-opted to RC. Although RC seem to play a crucial role to promote an efficient and productive replication cycle, a detailed analysis of their composition and associated activities has not been made. To facilitate the study of adenoviral RC and potentially those from other DNA viruses that replicate in the cell nucleus, we adapted a simple procedure based on velocity gradients to isolate Ad RC and established a cell-free system amenable to conduct morphological, functional and compositional studies of these virus-induced subnuclear structures, as well as to study their impact on host-cell interactions.
Introduction
Аденовирусы содержат геном двухцепочечной ДНК, который воспроизводит в ядре зараженной клетки. Когда вирусная ДНК проникает в ядро, она локализуется рядом с ПМЛ ядерных тел 1. После вирусной экспрессии генов раннего, ядерная архитектура резко реорганизована, вызывая образование вирусных микросреды, называется вирусной репликации Отсеки (RC) 2. Так аденовирус (объявление) RC сайты, где репликации вирусного генома и экспрессия вирусных генов конце происходят, они обеспечивают среду для вербовки всех необходимых вирусных и клеточных факторов, участвующих в этих процессах. Интересно, что различные клеточные белки, ответственные за сотовой противовирусной реакции, такие как реакции повреждения ДНК, врожденного иммунного ответа и подавление опухоли кооптированы этих вирусных сайтов 2. Следовательно, Объявление RC можно считать нормативные концентраторы, которые способствуют эффективной репликации вируса в то время как одновременно, регулирующихсотовая противовирусный ответ, указывая, что эти структуры являются ключевыми для понимания взаимодействий вирус-клеток-хозяев. Тем не менее, молекулярные механизмы формирования RC, их состав и связанные с ними мероприятия, плохо понимал.
Аденовирусный RC, а также RC от других вирусов ДНК, которые реплицируются в ядре не связаны с мембранами, в отличие от цитоплазматического RC 3. Кроме того, эти вирус-индуцированные структуры, вероятно, будут полностью состоит из белков и нуклеиновых кислот. RC формируется в клетках, инфицированных РНК-содержащих вирусов (обычно называют вирусные фабрики) были выделены, пользуясь их цитоплазматической локализации и мембраной статуса, который способствовал их детальное морфологическое, функциональное и биохимических характеристик 4.
По нашим сведениям, ядерным вирусная RC не были выделены, возможно, из-за сложности ядерной архитектуры и отсутствии внутри- мembranes, которые будут способствовать их изоляции. Их исследование опирается вместо этого на иммунофлюоресценции микроскопии, рыбы и просвечивающей электронной микроскопии. Тем не менее, несмотря на осложнения, присущие изоляции субъядерных структуры, другие ядерные домены, такие как ядрышек и Cajal органов были выделены, прежде чем 5,6. Так ядрышек и RC оба состоят из белков и нуклеиновых кислот, и имеют диаметр от 0,5 до 5 мкм -, мы предположили, что RC также должны быть пригодны для изоляции. Поэтому, для того, чтобы более точно охарактеризовать молекулярный состав и функции, связанные с дистанционным управлением, мы установили новый способ, чтобы изолировать субъядерных Фракции, обогащенные с дистанционным. Для этого мы подготовили суб-ядерным фракции, используя градиенты скорости и сахарозы подушки, подобные процедуры, используемые, чтобы изолировать ядрышки 7 или другие ядерные домены 6 и создана система бесклеточной, что позволяет изучение молекулярного состава и связанные деятельностьRC. Таким образом, этот метод следует улучшить понимание взаимодействия вирус-хозяин клеток и представляет собой мощный инструмент, который также должно способствовать детальный анализ RC от других вирусов, которые воспроизводят в ядре и вызвать образование репликации отсеков подобных размеров, чтобы те, которые образуются в adenovirus- инфицированных-клетки, такие как, вирусы герпеса, папилломы или polyomaviruses.
Protocol
Representative Results
Discussion
In order to elucidate the molecular mechanisms that govern regulation of cellular activities by viral infection understanding the composition and activities associated with RC would be instrumental. Therefore, to make a detailed analysis of RC, we established a cell-free system that takes advantage of the size and biochemical composition of these virus-induced structures, to isolate subnuclear fractions enriched with RC using a simple procedure that relies on velocity gradients with sucrose cushions. Critical steps of th…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from CONACyT-SEP (SEP-2008-84582; CB-2011-01-168497) and Promep-SEP for R.A.G.; P.H. received a scholarship from CONACyT (447442).
Materials
| DMEM | Gibco | 12100-046 | Warm in 37 ºC water bath before use |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 12484-028 | |
| Sucrose, Ultra Pure | Research Organics | 0928S | Prepare a 2.55 M stock solution and store at 4 ºC |
| Dounce homogenizer | Kontess Glass Company | 884900-0000 | |
| Branson 1800 Ultrasonic Bath | Branson | Z769533 SIGMA | Turn on 15 min before use. |
| Peroxidase AffiniPure F(ab')₂ Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-036-003 | Use at a 1:10,000 dilution in PBS/0.03% non-fat milk |
| Goat anti-Mouse IgG1 Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-21121 | Use at a 1:2,000 dilution in PBS |
| Silane-Prep Slides | Sigma | S4651-72EA | Open in a laminar flow cabinet |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Pierce ThermoScientific | 34080 |
References
- Doucas, V., et al. Adenovirus replication is coupled with the dynamic properties of the PML nuclear structure. Genes & Dev. 10, 196-207 (1996).
- Schmid, M., Speiseder, T., Dobner, T., Gonzalez, R. A. DNA virus replication compartments. J. Virol. 88, 1404-1420 (2014).
- Boon, J. A., Diaz, A., Ahlquist, P. Cytoplasmic viral replication complexes. Cell host microbe. 8, 77-85 (2010).
- Paul, D., Hoppe, S., Saher, G., Krijnse-Locker, J., Bartenschlager, R. Morphological and biochemical characterization of the membranous hepatitis C virus replication compartment. J. Virol. 87, 10612-10627 (2013).
- Busch, H., et al. Isolation of Nucleoli. Exp Cell Res. 24, 150-163 (1963).
- Lam, Y. W., Lyon, C. E., Lamond, A. I. Large-scale isolation of Cajal bodies from HeLa cells. Mol. Biol. Cell. 13, 2461-2473 (2002).
- Lam, Y. W., Trinkle-Mulcahy, L., Lamond, A. I. The nucleolus. J Cell Sci. 118, 1335-1337 (2005).
- Groitl, P., Dobner, T. Construction of adenovirus type 5 early region 1 and 4 virus mutants. Methods Mol Med. 130, 29-39 (2007).
- Reich, N. C., Sarnow, P., Duprey, E., Levine, A. J. Monoclonal antibodies which recognize native and denatured forms of the adenovirus DNA-binding protein. Virology. 128, 480-484 (1983).
- Leppard, K. N. Selective effects on adenovirus late gene expression of deleting the E1b 55K protein. J Gen Virol. 74 (Pt 4), 575-582 (1993).
- Gonzalez, R., Huang, W., Finnen, R., Bragg, C., Flint, S. J. Adenovirus E1B 55-kilodalton protein is required for both regulation of mRNA export and efficient entry into the late phase of infection in normal human fibroblasts. J. Virol. 80, 964-974 (2006).
- Castillo-Villanueva, E., et al. The Mre11 Cellular Protein Is Modified by Conjugation of Both SUMO-1 and SUMO-2/3 during Adenovirus Infection. ISRN Virology. 2014, 14 (2014).
- Morris, S. J., Scott, G. E., Leppard, K. N. Adenovirus late-phase infection is controlled by a novel L4 promoter. J. Virol. 84, 7096-7104 (2010).
- Wright, J., Leppard, K. N. The human adenovirus 5 L4 promoter is activated by cellular stress response protein p53. J. Virol. 87, 11617-11625 (2013).
