Many types of human brain tumors are localized to specific regions within the brain and are difficult to grow in culture. This protocol addresses the role of tumor microenvironment and investigates new drug treatments by analyzing fluorescent primary brain tumor cells growing in an organotypic mouse brain slice.
Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these tumors are not easily grown in standard culture conditions. Neurosphere cultures under serum-free conditions and orthotopic xenografts have expanded the range of tumors that can be maintained. However, many types of brain tumors remain difficult to propagate or study. This is particularly true for pediatric brain tumors such as pilocytic astrocytomas and medulloblastomas. This protocol describes a system that allows primary human brain tumors to be grown in culture. This quantitative assay can be used to investigate the effect of microenvironment on tumor growth, and to test new drug therapies. This protocol describes a system where fluorescently labeled brain tumor cells are grown on an organotypic brain slice from a juvenile mouse. The response of tumor cells to drug treatments can be studied in this assay, by analyzing changes in the number of cells on the slice over time. In addition, this system can address the nature of the microenvironment that normally fosters growth of brain tumors. This brain tumor organotypic slice co-culture assay provides a propitious system for testing new drugs on human tumor cells within a brain microenvironment.
Nyere kræftforskning har gjort betydelige fremskridt med at identificere genetiske mutationer, molekylære forandringer og mulige behandlinger for en række af hjernetumorer. Trods disse fremskridt er fortsat hjernetumorer en af de øverste årsager til kræft-relaterede dødsfald for voksne og børn. Begrænsende faktorer i hjernesvulst forskning omfatter den begrænsede tilgængelighed af primære patientprøver og cellelinjer og vanskeligheden ved at kopiere den unikke og heterogene hjerne mikromiljø i tilgængelige eksperimentelle systemer. For mange hjernetumorer de betingelser, der kræves for at opretholde tumorceller over tid er endnu ikke kendt. Selv for hjernetumorer, der kan dyrkes i cellesuspension som neurosfærer, kan dyrkningsbetingelser påvirke tumorcellerne 1,2. Faktisk tilsætningen af basisk fibroblastvækstfaktor eller epidermal vækstfaktor fremmer proliferation og differentiering inhibere kan ændre genekspression 1. Andre fremgangsmåder til økonomisk vækst, f.eks tumorcelletumor opformering i mus via ortotopisk eller subkutan xenograft af tumorceller er værdifulde assays, men er begrænset af faktorer såsom tidspunktet for tumorudvikling (især for lav kvalitet tumorer), omkostninger og antallet af tumorceller, som kan injiceres og undersøges . Således nuværende metoder til dyrkning menneskelige hjerne tumorceller er utilstrækkelige til at opretholde visse tumortyper, og giver ofte kunstige miljøer, der ikke nøje efterligner in vivo tumor miljøer.
Forskellige former for pædiatriske hjernetumorer vokse i højt specialiserede steder i hjernen [3, 4], og dette afspejler sandsynligvis distinkte microenvironmental krav til tumorvækst [5]. Denne protokol beskriver et hidtil ukendt system, hvor celler, der er vanskelige at udbrede sig i normale dyrkningsbetingelser kan dyrkes i organotypisk hjernen mikromiljø, som efterligner in vivo tumor vækstbetingelser. I denne kvantitativ analyse, fluorescens-mærkethjernetumorceller udplades på unge musehjerne organotypiske skiver og overvåges over tid. Dette assay kan anvendes til at undersøge effekten af mikromiljø på tumorvækst, og til at teste nye lægemiddelterapier i en klinisk relevant hjerne mikromiljø.
Denne protokol beskriver, hvordan hjernetumorceller kan fluorescensmærket og udpladet på en sagittal hjerne sektion af en P6 mus og overvåges så for en uge i kultur. Denne hjernetumor / organotypisk skive co-kultur-assay kan anvendes til at bestemme virkningen af regionale mikromiljø på tumorcellen nummer og kan også anvendes som et system til måling af effektiviteten af nye lægemiddelbehandlinger på menneskers tumorvækst. Tidligere undersøgelser har brugt en lignende strategi til at vurdere den …
The authors have nothing to disclose.
This work is supported by grants from the NIH (P01CA142536 to RAS, T32CA009361 to DPY) and the Pediatric Low Grade Astrocytoma foundation.
HEPES | Invitrogen | 17504044 | |||
Glucose | Invitrogen | 17502048 | |||
Pennicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |||
HBSS | Life Technologies | 14185-052 | |||
B-27 | Life Technologies | 17504-044 | |||
N2 | Life Technologies | 17502-048 | |||
Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |||
Neurobasal-A- Medium minus phenol red | Invitrogen | 12349015 | |||
Low Melting Point Agarose | Promega | V2111 | |||
Slice Culture Inserts | Milipore | PICM0RG50 | |||
laminin | Invitrogen | 23017015 | |||
Cm-DiI | Invitrogen | V22888 | |||
EDU (Labeling and Detection) | Life Technologies | c10337 | |||
Microspheres | Life Technologies | F-21010 | |||
Vibratome | Leica | N/A | |||
Confocal Microscope | Nikon Eclipse Ni C2si | N/A | |||
Image J software | N/A | N/A | |||
5mm Cover Glasses | Fisher Scientific | 64-0700 (CS-5R) |