İlaç Tedavileri tümörün mikro incelenmesi ve Hedeflenen A Beyin Tümörü / Organotipik Dilim Co-kültür Sistemi
Summary
Many types of human brain tumors are localized to specific regions within the brain and are difficult to grow in culture. This protocol addresses the role of tumor microenvironment and investigates new drug treatments by analyzing fluorescent primary brain tumor cells growing in an organotypic mouse brain slice.
Abstract
Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these tumors are not easily grown in standard culture conditions. Neurosphere cultures under serum-free conditions and orthotopic xenografts have expanded the range of tumors that can be maintained. However, many types of brain tumors remain difficult to propagate or study. This is particularly true for pediatric brain tumors such as pilocytic astrocytomas and medulloblastomas. This protocol describes a system that allows primary human brain tumors to be grown in culture. This quantitative assay can be used to investigate the effect of microenvironment on tumor growth, and to test new drug therapies. This protocol describes a system where fluorescently labeled brain tumor cells are grown on an organotypic brain slice from a juvenile mouse. The response of tumor cells to drug treatments can be studied in this assay, by analyzing changes in the number of cells on the slice over time. In addition, this system can address the nature of the microenvironment that normally fosters growth of brain tumors. This brain tumor organotypic slice co-culture assay provides a propitious system for testing new drugs on human tumor cells within a brain microenvironment.
Introduction
Yeni kanser araştırma beyin tümörlerinin çeşitli genetik mutasyonlar, moleküler değişiklikler ve olası tedavileri belirlenmesinde önemli ilerlemeler kaydetmiştir. Bu gelişmelere rağmen, beyin tümörleri, yetişkinler ve çocuklar için kanserle ilgili mortalite üst nedenlerinden biri olmaya devam etmektedir. Beyin tümörü araştırma üzerinde sınırlandırıcı etkenler primer hasta örnekleri ve hücre çizgileri kısıtlı kullanılabilirliği ve erişilebilir deneysel sistemlerde benzersiz ve heterojen beyin mikro-çoğaltma zorluk bulunmaktadır. Birçok beyin için zamanla henüz bilinmemektedir tümör hücrelerini korumak için gerekli koşulları tümörler. Hatta neurospheres hücre süspansiyon içinde yetiştirilebilir beyin tümörleri için, kültür koşulları tümör hücrelerini 1,2 etkileyebilir. Gerçekten de, bazik fibroblast büyüme faktörü veya epidermal büyüme faktörü eklenmesi çoğalmasını teşvik etmek ve gen ekspresyonunu 1 değiştirebilir farklılaşmasını inhibe etmek. Tümör hücresi büyümesi için diğer yöntemler gibiTümör hücrelerinin ortotopik ya da deri altı doku yaması yoluyla farelerde, tümör yayılımı gibi değerli tahliller vardır, ancak bu enjekte edilmiş ve incelenebilir tümör gelişimi (özellikle düşük dereceli tümörler için), maliyeti ve tümör hücrelerinin sayısında bir zamanı gibi faktörlere ile sınırlıdır . İnsan beyni tümör hücrelerinin büyümesi için Böylece güncel yöntemler bazı tümör türleri korumak için yetersiz ve çoğunlukla yakından taklit in vivo tümör ortamları yok yapay ortamlar sağlamaktadır.
Pediatrik beyin tümörlerinin Farklı türleri beynin içinde son derece uzmanlaşmış yerlerde yetişen [3, 4] ve bu tümör büyümesi için ayrı ayrı microenvironmental gereksinimlerini yansıtmak muhtemeldir [5]. Bu protokol, normal kültür koşullarında yaymak için zor olan hücreler Organotipik beyin mikro-yetiştirilebilir yeni bir sistemi tarif vivo tümör büyüme koşullarında taklit eden. Bu niceliksel deneyde, floresanla işaretlenmişbeyin tümörü hücreleri, bir jüvenil fare beyin Organotipik dilimleri üzerine kaplanmıştır ve zaman içinde kontrol edilir. Bu tahlil, tümör büyümesi üzerine mikroçevresinin etkisini araştırmak için, ve klinik olarak anlamlı beyin mikroçevresinin yeni ilaç tedavileri test etmek için kullanılır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, beyin tümör hücreleri floresan etiketli ve P6 fare sagital beyin bölümünde kaplama ve sonra kültürde bir hafta izlenebilir açıklanır. Bu beyin tümörü / Organotipik dilim ko-kültür deneyi, tümör hücre sayısı bölgesel mikro-etkisini belirlemek için kullanılabilir ve aynı zamanda insan tümör büyümesi üzerine yeni bir ilaç tedavilerinin etkisini ölçmek için bir sistem olarak da kullanılabilir. Önceki çalışmalar nöral prekürsör çoğalma 7,8 beyin mikro-çevre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is supported by grants from the NIH (P01CA142536 to RAS, T32CA009361 to DPY) and the Pediatric Low Grade Astrocytoma foundation.
Materials
| HEPES | Invitrogen | 17504044 | |||
| Glucose | Invitrogen | 17502048 | |||
| Pennicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |||
| HBSS | Life Technologies | 14185-052 | |||
| B-27 | Life Technologies | 17504-044 | |||
| N2 | Life Technologies | 17502-048 | |||
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |||
| Neurobasal-A- Medium minus phenol red | Invitrogen | 12349015 | |||
| Low Melting Point Agarose | Promega | V2111 | |||
| Slice Culture Inserts | Milipore | PICM0RG50 | |||
| laminin | Invitrogen | 23017015 | |||
| Cm-DiI | Invitrogen | V22888 | |||
| EDU (Labeling and Detection) | Life Technologies | c10337 | |||
| Microspheres | Life Technologies | F-21010 | |||
| Vibratome | Leica | N/A | |||
| Confocal Microscope | Nikon Eclipse Ni C2si | N/A | |||
| Image J software | N/A | N/A | |||
| 5mm Cover Glasses | Fisher Scientific | 64-0700 (CS-5R) | |||
References
- Heddleston, J. M., et al. Glioma stem cell maintenance: the role of the microenvironment. Curr Pharm Des. 17 (23), 2386-2401 (2013).
- Sasai, K. Shh pathway activity is down-regulated in cultured medulloblastoma cells: implications for preclinical studies. Cancer Res. 66 (8), 4215-4222 (2006).
- Louis, D. N., et al. The 2007 WHO classification of tumours of the central nervous system. Acta Neuropathol. 114 (2), 97-109 (2007).
- Duffau, H., Capelle, L. Preferential brain locations of low-grade gliomas. Cancer. 100 (12), 2622-2626 (2004).
- Chourmouzi, D., et al. Manifestations of pilocytic astrocytoma: a pictorial review. Insights Imaging. 5 (3), 387-402 (2014).
- Buonamici, S., et al. Interfering with resistance to smoothened antagonists by inhibition of the PI3K pathway in medulloblastoma. Sci Transl Med. 2 (51), 51ra70 (2010).
- Choi, Y., Borghesani, P. R., Chan, J. A., Segal, R. A. Migration from a mitogenic niche promotes cell-cycle exit. J Neurosci. 25 (45), 10437-10445 (2005).
- Chan, J. A., et al. Proteoglycan interactions with Sonic Hedgehog specify mitogenic responses. Nat Neurosci. 12 (4), 409-417 (2009).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Kenny, H. A., et al. Quantitative high throughput screening using a primary human three- dimensional organotypic culture predicts in vivo efficacy. Nat Commun. 6, 6220 (2015).
- Liu, X., et al. ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells. Am J Pathol. 180 (2), 599-607 (2012).
