גידול במוח / Organotypic Slice משותף תרבות מערכת לימוד microenvironment גידול וממוקד תרופות טיפולים
Summary
Many types of human brain tumors are localized to specific regions within the brain and are difficult to grow in culture. This protocol addresses the role of tumor microenvironment and investigates new drug treatments by analyzing fluorescent primary brain tumor cells growing in an organotypic mouse brain slice.
Abstract
Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these tumors are not easily grown in standard culture conditions. Neurosphere cultures under serum-free conditions and orthotopic xenografts have expanded the range of tumors that can be maintained. However, many types of brain tumors remain difficult to propagate or study. This is particularly true for pediatric brain tumors such as pilocytic astrocytomas and medulloblastomas. This protocol describes a system that allows primary human brain tumors to be grown in culture. This quantitative assay can be used to investigate the effect of microenvironment on tumor growth, and to test new drug therapies. This protocol describes a system where fluorescently labeled brain tumor cells are grown on an organotypic brain slice from a juvenile mouse. The response of tumor cells to drug treatments can be studied in this assay, by analyzing changes in the number of cells on the slice over time. In addition, this system can address the nature of the microenvironment that normally fosters growth of brain tumors. This brain tumor organotypic slice co-culture assay provides a propitious system for testing new drugs on human tumor cells within a brain microenvironment.
Introduction
מחקר הסרטן אחרון הפך התקדמות משמעותית בזיהוי מוטציות גנטיות, שינויים מולקולריים וטיפולים אפשריים עבור מגוון רחב של גידולים במוח. למרות התקדמות זו, גידולים במוח נשארים אחד הגורמים העליונים של תמותה הקשורים לסרטן למבוגרים ולילדים. גורמים מגבילים במחקר גידול במוח כוללים את הזמינות המוגבלת של דגימות מטופל ראשוניות ושורות תאים וקושי בשכפול microenvironment המוח הייחודי והטרוגנית במערכות ניסיוניות נגישות. עבור רבים מוח גידולים התנאים הנדרשים כדי לשמור על תאים סרטניים לאורך הזמן עדיין לא ידועים. אפילו לגידולים במוח שניתן לגדל בהשעית תא כneurospheres, תנאי התרבות יכולים להשפיע על התאים הסרטניים 1,2. ואכן, התוספת של גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי או גורם גדילה באפידרמיס לעודד התפשטות ומעכבות בידול עשוי לשנות ביטוי גני 1. שיטות אחרות לתאים סרטניים גידול כזהכהתפשטות גידולים בעכברים באמצעות xenograft orthotopic או תת עורי של תאים סרטניים הם מבחני חשובים, אבל מוגבלים על ידי גורמים כמו זמן של התפתחות גידולים (בעיקר לגידולים בדרגה נמוכות), עלות, ומספר התאים הסרטניים שיכול להיות מוזרק ולמד . שיטות לפיכך הנוכחיות לגידול תאים סרטניים במוח אנושי אינן מספיקות לשמירה על סוגים מסוימים של גידול, ולעתים קרובות מספקות סביבות מלאכותיות שאינן הדוק סביבות גידול לחקות in vivo.
סוגים שונים של גידולים במוח בילדים לגדול במקומות מאוד מיוחדים בתוך המוח [3, 4] וזה עשוי לשקף דרישות microenvironmental מובהקות לצמיחת גידול [5]. פרוטוקול זה מתאר מערכת רומן שבו תאים שקשה להפיץ בתנאי תרבות נורמלים ניתן לגדל במייקרו-סביבת מוח organotypic שמחקה בתנאי גידול vivo. בassay כמותי זה, שכותרתו fluorescentlyתאי גידול במוח הם מצופים בפרוסות organotypic מוח עכבר לנוער ומעקב לאורך זמן. assay זה יכול לשמש כדי לחקור את ההשפעה של מייקרו-סביבה בגידול, ולבחון טיפולים תרופתיים חדשים במייקרו-סביבת מוח רלוונטי מבחינה קלינית.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מתאר כיצד יכול להיות מתויג תאי גידול במוח fluorescently ומצופים בסעיף מוח sagittal של עכבר P6 ולאחר מכן במעקב במשך שבוע אחד בתרבות. גידול במוח / assay שיתוף התרבות הפרוסה organotypic זה יכול לשמש כדי לקבוע את ההשפעה של מייקרו-סביבה האזורית על מספר תאים סרטניים ועשוי לשמש גם כ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is supported by grants from the NIH (P01CA142536 to RAS, T32CA009361 to DPY) and the Pediatric Low Grade Astrocytoma foundation.
Materials
| HEPES | Invitrogen | 17504044 | |||
| Glucose | Invitrogen | 17502048 | |||
| Pennicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |||
| HBSS | Life Technologies | 14185-052 | |||
| B-27 | Life Technologies | 17504-044 | |||
| N2 | Life Technologies | 17502-048 | |||
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |||
| Neurobasal-A- Medium minus phenol red | Invitrogen | 12349015 | |||
| Low Melting Point Agarose | Promega | V2111 | |||
| Slice Culture Inserts | Milipore | PICM0RG50 | |||
| laminin | Invitrogen | 23017015 | |||
| Cm-DiI | Invitrogen | V22888 | |||
| EDU (Labeling and Detection) | Life Technologies | c10337 | |||
| Microspheres | Life Technologies | F-21010 | |||
| Vibratome | Leica | N/A | |||
| Confocal Microscope | Nikon Eclipse Ni C2si | N/A | |||
| Image J software | N/A | N/A | |||
| 5mm Cover Glasses | Fisher Scientific | 64-0700 (CS-5R) | |||
References
- Heddleston, J. M., et al. Glioma stem cell maintenance: the role of the microenvironment. Curr Pharm Des. 17 (23), 2386-2401 (2013).
- Sasai, K. Shh pathway activity is down-regulated in cultured medulloblastoma cells: implications for preclinical studies. Cancer Res. 66 (8), 4215-4222 (2006).
- Louis, D. N., et al. The 2007 WHO classification of tumours of the central nervous system. Acta Neuropathol. 114 (2), 97-109 (2007).
- Duffau, H., Capelle, L. Preferential brain locations of low-grade gliomas. Cancer. 100 (12), 2622-2626 (2004).
- Chourmouzi, D., et al. Manifestations of pilocytic astrocytoma: a pictorial review. Insights Imaging. 5 (3), 387-402 (2014).
- Buonamici, S., et al. Interfering with resistance to smoothened antagonists by inhibition of the PI3K pathway in medulloblastoma. Sci Transl Med. 2 (51), 51ra70 (2010).
- Choi, Y., Borghesani, P. R., Chan, J. A., Segal, R. A. Migration from a mitogenic niche promotes cell-cycle exit. J Neurosci. 25 (45), 10437-10445 (2005).
- Chan, J. A., et al. Proteoglycan interactions with Sonic Hedgehog specify mitogenic responses. Nat Neurosci. 12 (4), 409-417 (2009).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Kenny, H. A., et al. Quantitative high throughput screening using a primary human three- dimensional organotypic culture predicts in vivo efficacy. Nat Commun. 6, 6220 (2015).
- Liu, X., et al. ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells. Am J Pathol. 180 (2), 599-607 (2012).
