miRNAの脳特異的ノックダウンのための定位注射への単純な代替
Summary
MicroRNAs play crucial roles in the brain and are potential targets for modeling neuro-degeneration. However, perturbing miRNA levels is challenging due to the short length of miRNA and inaccessibility of the brain tissue. This video presents a method for antagomir design and brain specific delivery using a neuropeptide in mice.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) are key regulators of gene expression. In the brain, vital processes like neurodevelopment and neuronal functions depend on the correct expression of microRNAs. Perturbation of microRNAs in the brain can be used to model neurodegenerative diseases by modulating neuronal cell death. Currently, stereotactic injection is used to deliver miRNA knockdown agents to specific location in the brain. Here, we discuss strategies to design antagomirs against miRNA with locked nucleotide modifications (LNA). Subsequently describe a method for brain specific delivery of antagomirs, uniformly across different regions of the brain. This method is simple and widely applicable since it overcomes the surgery, associated injury and limitation of local delivery in stereotactic injections. We prepared a complex of neurotropic, cell-penetrating peptide Rabies Virus Glycoprotein (RVG) with antagomir against miRNA-29 and injected through tail vein, to specifically deliver in the brain. The antagomir design incorporated features that allow specific targeting of the miRNA and formation of non-covalent complexes with the peptide. The knock-down of the miRNA in neuronal cells, resulted in apoptotic cell death and associated behavioural defects. Thus, the method can be used for acute models of neuro-degeneration through the perturbation of miRNAs.
Introduction
マイクロRNAは、遺伝子発現と疾患への関与のための直接的な証拠の調節におけるそれらの普遍的役割に起因する新規治療ターゲットとして浮上しています。薬は1,2をターゲットとして、miRNAは、積極的に自分の可能性について検討されています。さらに、miRNA発現の変化は、いくつかの疾患および3 miRNA発現の人工的な摂動により、これらの変化のシミュレーションが疾患症状に関与する細胞経路を研究するために使用することが可能に関連付けられています。 miRNAを標的とする薬剤の組織特異的送達は、現在のmiRNAベースの薬剤開発のための大きな課題です。アンタゴとのmiRNA模倣体は、miRNAレベル4-6を摂動するための有望な薬剤です。しかし、それらの特異性および有効性を高める特殊な特徴は、それらがmiRNA発現のインビボでの摂動のために使用することができる前に、アンタゴの設計に組み込まれなければなりません。
マイクロRNAは、特に関連しています現在不治の神経変性および神経発達疾患における標的として。血液脳関門は、脳内のアンタゴの配信に制限を課します。定位注射は広く脳7内の特定の位置に分子を送達するためのげっ歯類モデルで使用されています。それは、スキル、計測および時間の大規模な投資を必要とします。定位注射は侵襲的であり、手術を伴う、少なくとも軽傷を引き起こし、ローカル配信に制限されます。ニューロンを標的化するための嗜好を有するペプチドを貫通する細胞の使用は、それらがトランス血管経路を介して送達することができるので、これらの制限に対抗するが、血液脳関門を破ることができます。狂犬病ウイルス糖タンパク質（RVG）に由来するようなペプチドは、以前にマウス8で日本脳炎ウイルスに対するsiRNAを送達するために使用されました。私たちは、アンタゴmir配信のためにペプチドを使用して、miRNAが効果的にマウス脳9にノックダウンできることを見出しました。
ontent "> miRNAの第二の主要課題は、ノックダウンは、miRNAの小さなサイズから生じると密接に関連した配列の存在は、私たちは3の密接に関連したアイソフォームで構成されてMMU-のmiR-29ファミリー、のmiR-29aの例を取る。アイソフォームa、bおよびc。アンタゴはまた、一般的にその安定性を向上させ、ヌクレアーゼによる攻撃にそれらが耐性をレンダリングするために骨格に沿って変更されます。ロックされた核酸（LNAのは）彼らは熱安定性を向上させるというさらなる利点を提供し、さらにオーバー以降劣化をターゲットにつながります立体障害10。すべての骨格に沿って修正を導入することは有効であるが高価になることができます。私たちは、以前の最適な数を超えた修正は、さらに有効性を増強ない可能性があることを見てきました。アンタゴの設計は、したがって、アンタゴの最適な変更を伴います。向神経ペプチドと非共有結合的に複雑なアンタゴには、ノナアルギニン内線にヘプタ充電に使用されます。 D-アルギニン彼らは、プロテアーゼによる切断を受けないよう、より高い安定性を付与するため、残基が使用されています。ノナアルギニンストレッチにヘプタは、それらが細胞型特異性を付与しませんが、効率的細胞透過剤として作用します。共有結合ノナアルギニンリンカーにRVGペプチドをリンクすることにより、神経向性、細胞透過性ペプチドを生成しました。ペプチドの正に荷電した残基は、複合体を形成するために、負に帯電した核酸骨格と相互作用します。これらの複合体は、効果的に培養された細胞内および組織内へのインビボでの DNAまたはRNAをトランスフェクトするために使用することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
Here we demonstrate a widely accessible methodology to study the effects of miRNA modulation. Currently, most attempts at in vivo characterization of miRNA functions involve the creation of knockout mice or a transgenic that expresses a miRNA sponge. Most miRNAs, even the cell type specific ones are expressed in more than one organ. For instance, miRNAs initially thought to be specific to the hematopoietic system are also expressed in the brain, due to the presence of microglia. Thus even a cell type specifi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Souvik Maiti for help in designing the antagomirs. We also acknowledge Rangeetha J. Naik, Rakesh Dey, and Bijay Pattnaik for their help with experimental methods. This work was funded by the Council of Scientific and Industrial Research (BSC0123). HS, MV and RR acknowledge fellowship from the Council of Scientific and Industrial Research, India. MAS acknowledge fellowship from the University Grants Commission, India.
Materials
| Vortex | |||
| Restrainer or Decapicone | |||
| Narrow runway | ~70-cm-long, ~5-cm-wide with ~5-cm-high walls. | ||
| Reagents | |||
| Fluorescently labelled oligonucleotides (siGLO) | GE Healthcare Dharmacon INC | D0016300120 | |
| 10% sterile D-glucose | |||
| Antagomir-29 | Exiqon | custom synthesis | |
| Antagomir-control | Exiqon | custom synthesis | |
| Neuropeptide RVG | G.L.Biochem (Shanghai) Ltd. | custom synthesis | >98% purity |
| Neuropeptide RVM | G.L.Biochem (Shanghai) Ltd. | custom synthesis | >98% purity |
| Other | |||
| Cotton | |||
| Warm water | |||
| Insulin syringes | |||
| Absorbent sheets | |||
| Ink | |||
| Brush | |||
| Antiseptic |
References
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