miRNA의 뇌의 특정 최저 대한 정위 주입하는 간단한 대안
Summary
MicroRNAs play crucial roles in the brain and are potential targets for modeling neuro-degeneration. However, perturbing miRNA levels is challenging due to the short length of miRNA and inaccessibility of the brain tissue. This video presents a method for antagomir design and brain specific delivery using a neuropeptide in mice.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) are key regulators of gene expression. In the brain, vital processes like neurodevelopment and neuronal functions depend on the correct expression of microRNAs. Perturbation of microRNAs in the brain can be used to model neurodegenerative diseases by modulating neuronal cell death. Currently, stereotactic injection is used to deliver miRNA knockdown agents to specific location in the brain. Here, we discuss strategies to design antagomirs against miRNA with locked nucleotide modifications (LNA). Subsequently describe a method for brain specific delivery of antagomirs, uniformly across different regions of the brain. This method is simple and widely applicable since it overcomes the surgery, associated injury and limitation of local delivery in stereotactic injections. We prepared a complex of neurotropic, cell-penetrating peptide Rabies Virus Glycoprotein (RVG) with antagomir against miRNA-29 and injected through tail vein, to specifically deliver in the brain. The antagomir design incorporated features that allow specific targeting of the miRNA and formation of non-covalent complexes with the peptide. The knock-down of the miRNA in neuronal cells, resulted in apoptotic cell death and associated behavioural defects. Thus, the method can be used for acute models of neuro-degeneration through the perturbation of miRNAs.
Introduction
마이크로 RNA에 의한 유전자 발현과 질병에의 참여에 대한 직접적인 증거의 규제에서의 보편적 인 역할에 새로운 치료 대상으로 등장했다. 약물이 1, 2를 대상으로 miRNA가 적극적으로 자신의 잠재력에 대한 탐구되고있다. 더욱이, miRNA의 발현의 변화가 여러 질환 3의 miRNA 발현의 인공 섭동에 의한 이러한 변화의 시뮬레이션과 관련된 질병의 발현에 관여하는 세포 경로를 연구하기 위해 사용될 수있다. miRNA의 표적 약물의 조직 특정 배달은 현재의 miRNA 기반 신약 개발의 주요 과제입니다. Antagomirs 및 miRNA의 모방은 miRNA의 레벨 4-6을 교란하기위한 유망 에이전트입니다. 그러나, 특이성 및 효능을 향상 특징들은 miRNA의 발현 생체 섭동에 사용될 수 있기 전에 antagomirs의 디자인에 혼입 될 수있다.
마이크로 RNA는 특히 관련이 현재 불치의 퇴행성 신경과 신경 발달 질환 대상으로. 혈액 – 뇌 장벽은 뇌에 antagomirs의 전달에 제한을 포즈. 정위 주사 널리 7 뇌의 특정 위치로 분자를 전달하는 설치류 모델에서 사용된다. 그것은 기술, 계측 및 시간에 광범위한 투자를 필요로한다. 정위 주사는 적어도 경미한 부상의 원인, 수술을 포함하고 로컬 배달로 제한됩니다, 침략이다. 표적 뉴런의 설정에 셀 관통 펩티드의 사용은 트랜스 혈관 경로를 통해 전달 될 수 있기 때문에 이러한 제한에 대응하지만, 혈액 뇌 장벽을 위반할 수있다. 광견병 바이러스 당 단백질 (RVG) 유래의 펩타이드 등, 이전 쥐 8 일본 뇌염 바이러스에 대한 siRNA를 전달하기 위해 사용되었다. 우리는 antagomir 배달 펩타이드를 사용하여,의 miRNAs 효과적으로 할 수 마우스 뇌 9 무너 뜨렸다 수 있다는 것을 발견했다.
ontent ">의 miRNA의 두 번째 주요 과제는 노크 다운의 miRNAs의 작은 크기와 밀접한 관련이 시퀀스 동종의 존재에서 발생한다. 우리는 세 밀접하게 관련 동종 구성-은 miR-29 MMU 가족의 예를 취할 미르-29A 핵산 (LNA들)이 그들은 심지어 열 안정성을 향상시키고 또 다른 장점을 제공 잠금, b와 c. Antagomirs는 일반적으로 안정성을 높이고 뉴 클레아의 공격에 저항하는 렌더링하는 백본을 따라 수정됩니다. 이상과 그 이후 저하를 대상으로지도 입체 장애 (10). 모든 백본을 따라 수정을 소개하는 것은 효과가 있지만 비용이 많이들 수 있습니다. 우리는 이전의 최적의 수를 넘어 수정이 더 효과를 강화하지 않을 수 있음을 보았다. antagomir의 디자인은 따라서 antagomir의 최적의 수정을 포함한다.복잡한 antagomir 비공유 노나 아르기닌 확장에 neurotropic 펩타이드, 충전 헵타와 함께 사용된다. D-아르기닌그들은 단백질 분해 효소에 의해 분해에 민감하지 않은으로 높은 안정성을 부여하기 때문에 잔류 물이 사용된다. 노나 아르기닌까지 뻗어 헵타은 세포 유형 특이성을 부여하지 않지만, 효율적인 세포 침투제의 역할. 공유 노나 아르기닌 링커 neurotropic, 세포 투과 펩티드가 생성되었던 RVG 펩티드 연결함으로써. 펩티드의 양으로 하전 된 잔기가 복합체를 형성하기 위해, 음으로 하전 된 핵산 백본과 상호 작용. 이러한 착물은 효과적으로 배양 세포 내로 생체 내에서 조직 내로 DNA 또는 RNA를 형질 감염 할 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
Here we demonstrate a widely accessible methodology to study the effects of miRNA modulation. Currently, most attempts at in vivo characterization of miRNA functions involve the creation of knockout mice or a transgenic that expresses a miRNA sponge. Most miRNAs, even the cell type specific ones are expressed in more than one organ. For instance, miRNAs initially thought to be specific to the hematopoietic system are also expressed in the brain, due to the presence of microglia. Thus even a cell type specifi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Souvik Maiti for help in designing the antagomirs. We also acknowledge Rangeetha J. Naik, Rakesh Dey, and Bijay Pattnaik for their help with experimental methods. This work was funded by the Council of Scientific and Industrial Research (BSC0123). HS, MV and RR acknowledge fellowship from the Council of Scientific and Industrial Research, India. MAS acknowledge fellowship from the University Grants Commission, India.
Materials
| Vortex | |||
| Restrainer or Decapicone | |||
| Narrow runway | ~70-cm-long, ~5-cm-wide with ~5-cm-high walls. | ||
| Reagents | |||
| Fluorescently labelled oligonucleotides (siGLO) | GE Healthcare Dharmacon INC | D0016300120 | |
| 10% sterile D-glucose | |||
| Antagomir-29 | Exiqon | custom synthesis | |
| Antagomir-control | Exiqon | custom synthesis | |
| Neuropeptide RVG | G.L.Biochem (Shanghai) Ltd. | custom synthesis | >98% purity |
| Neuropeptide RVM | G.L.Biochem (Shanghai) Ltd. | custom synthesis | >98% purity |
| Other | |||
| Cotton | |||
| Warm water | |||
| Insulin syringes | |||
| Absorbent sheets | |||
| Ink | |||
| Brush | |||
| Antiseptic |
References
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