Ett enkelt alternativ till stereotaktisk injektion för Brain Specifik Knockdown av miRNA
Summary
MicroRNAs play crucial roles in the brain and are potential targets for modeling neuro-degeneration. However, perturbing miRNA levels is challenging due to the short length of miRNA and inaccessibility of the brain tissue. This video presents a method for antagomir design and brain specific delivery using a neuropeptide in mice.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) are key regulators of gene expression. In the brain, vital processes like neurodevelopment and neuronal functions depend on the correct expression of microRNAs. Perturbation of microRNAs in the brain can be used to model neurodegenerative diseases by modulating neuronal cell death. Currently, stereotactic injection is used to deliver miRNA knockdown agents to specific location in the brain. Here, we discuss strategies to design antagomirs against miRNA with locked nucleotide modifications (LNA). Subsequently describe a method for brain specific delivery of antagomirs, uniformly across different regions of the brain. This method is simple and widely applicable since it overcomes the surgery, associated injury and limitation of local delivery in stereotactic injections. We prepared a complex of neurotropic, cell-penetrating peptide Rabies Virus Glycoprotein (RVG) with antagomir against miRNA-29 and injected through tail vein, to specifically deliver in the brain. The antagomir design incorporated features that allow specific targeting of the miRNA and formation of non-covalent complexes with the peptide. The knock-down of the miRNA in neuronal cells, resulted in apoptotic cell death and associated behavioural defects. Thus, the method can be used for acute models of neuro-degeneration through the perturbation of miRNAs.
Introduction
MicroRNAs har dykt upp som nya terapeutiska mål på grund av sin universella roll vid regleringen av genuttryck och direkt bevis för inblandning i sjukdom. MiRNA är aktivt utforskas för sin potential som målproteiner 1,2. Vidare förändringar i miRNA uttryck i samband med flera sjukdomar 3 och simulering av dessa förändringar genom artificiell störning av miRNA uttryck kan användas för att studera de cellulära vägarna inblandade i sjukdomsmanifestation. Vävnadsspecifika leverans av miRNA inriktnings läkemedel är för närvarande en stor utmaning för miRNA baserad läkemedelsutveckling. Antagomirs och miRNA härmar är lovande medel för störande miRNA nivåer 4-6. Men speciella funktioner som förbättrar deras specificitet och effektivitet måste införlivas i utformningen av antagomirs innan de kan användas för in vivo störning av miRNA uttryck.
MicroRNAs är särskilt relevanta som mål i närvarande obotlig neurodegenerativa och neuroutvecklingssjukdomar. Blod-hjärnbarriären utgör en begränsning till leveransen av antagomirs i hjärnan. Stereotaktiska injektioner används ofta i gnagarmodeller att leverera molekyler till specifika platser i hjärnan 7. Det kräver skicklighet, omfattande investeringar i instrumentering och tid. Stereotaktiska injektioner är invasiva, innebär kirurgi, orsaka åtminstone mindre skada och är begränsade till lokal leverans. Användningen av cellpenetrerande peptider med en preferens för inriktnings neuroner kan motverka dessa begränsningar, eftersom de kan tillföras genom det trans vaskulär väg men bryta blodhjärnbarriären. En sådan peptid härledd från rabiesvirus glykoprotein (RVG), har tidigare använts för att leverera siRNA mot japansk encefalitvirus i möss 8. Vi fann att användning av peptiden för antagomir leverans, kan miRNAs vara effektivt slog ner i mushjärna 9.
INNEHÅLL "> Den andra stora utmaningen miRNA knock-down härrör från den lilla storleken av miRNA och närvaron av närbesläktade sekvens isoformer. Vi tar exemplet med MMU-MIR-29 familjen som består av tre närbesläktade isoformer, MIR-29a , b och c. Antagomirs är också i allmänhet modifieras längs ryggraden för att öka deras stabilitet och göra dem resistenta mot angrepp av nukleaser. Låst nukleinsyror (LNA) erbjuda en ytterligare fördel att de ökar termisk stabilitet och även leda till mål nedbrytning över och bortom steriskt hinder 10. Presentation modifieringar längs ryggraden kan vara effektivt men dyrt. Vi har tidigare sett att modifieringar utöver ett optimalt antal inte vidare kan förstärka effektiviteten. Utformningen av antagomir involverar därför den optimala modifiering av antagomir.Till komplexet antagomir icke-kovalent med neurotrop peptid, en laddad hepta- till nona-arginin förlängning används. D-argininrester används, eftersom de ger högre stabilitet, eftersom de inte är känsliga för klyvning av proteaser. Hepta- till nona-arginin sträckor fungerar som effektiva cell penetrerande medel, även om de inte ger celltyp specificitet. Genom att kovalent binda RVG peptiden till nona-arginin länk, en neurotrop, cellpenetrerande peptid genererades. De positivt laddade resterna i peptiden interagerar med den negativt laddade nukleinsyran ryggraden, för att bilda komplex. Dessa komplex kan användas för att effektivt transfektera DNA eller RNA i odlade celler och in vivo in i vävnader.
Protocol
Representative Results
Discussion
Here we demonstrate a widely accessible methodology to study the effects of miRNA modulation. Currently, most attempts at in vivo characterization of miRNA functions involve the creation of knockout mice or a transgenic that expresses a miRNA sponge. Most miRNAs, even the cell type specific ones are expressed in more than one organ. For instance, miRNAs initially thought to be specific to the hematopoietic system are also expressed in the brain, due to the presence of microglia. Thus even a cell type specifi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Souvik Maiti for help in designing the antagomirs. We also acknowledge Rangeetha J. Naik, Rakesh Dey, and Bijay Pattnaik for their help with experimental methods. This work was funded by the Council of Scientific and Industrial Research (BSC0123). HS, MV and RR acknowledge fellowship from the Council of Scientific and Industrial Research, India. MAS acknowledge fellowship from the University Grants Commission, India.
Materials
| Vortex | |||
| Restrainer or Decapicone | |||
| Narrow runway | ~70-cm-long, ~5-cm-wide with ~5-cm-high walls. | ||
| Reagents | |||
| Fluorescently labelled oligonucleotides (siGLO) | GE Healthcare Dharmacon INC | D0016300120 | |
| 10% sterile D-glucose | |||
| Antagomir-29 | Exiqon | custom synthesis | |
| Antagomir-control | Exiqon | custom synthesis | |
| Neuropeptide RVG | G.L.Biochem (Shanghai) Ltd. | custom synthesis | >98% purity |
| Neuropeptide RVM | G.L.Biochem (Shanghai) Ltd. | custom synthesis | >98% purity |
| Other | |||
| Cotton | |||
| Warm water | |||
| Insulin syringes | |||
| Absorbent sheets | |||
| Ink | |||
| Brush | |||
| Antiseptic |
References
- Roshan, R., Ghosh, T., Scaria, V., Pillai, B. MicroRNAs: novel therapeutic targets in neurodegenerative diseases. Drug discovery today. 14, 1123-1129 (2009).
- Maes, O. C., Chertkow, H. M., Wang, E., Schipper, H. M. MicroRNA: Implications for Alzheimer Disease and other Human CNS Disorders. Current Genomics. 10, 154-168 (2009).
- Soifer, H. S., Rossi, J. J., Saetrom, P. MicroRNAs in Disease and Potential Therapeutic Applications. Mol Ther. 15, 2070-2079 (2007).
- Bader, A. G., Brown, D., Winkler, M. The Promise of MicroRNA Replacement Therapy. Cancer research. 70, 7027-7030 (2010).
- Stenvang, J., Petri, A., Lindow, M., Obad, S., Kauppinen, S. Inhibition of microRNA function by antimiR oligonucleotides. Silence. 3, 1-17 (2012).
- Trang, P., et al. Systemic Delivery of Tumor Suppressor microRNA Mimics Using a Neutral Lipid Emulsion Inhibits Lung Tumors in Mice. Molecular Therapy. 19, 1116-1122 (2011).
- Barbash, S., Hanin, G., Soreq, H. Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome. J Vis Exp. (76), e50170 (2013).
- Kumar, P., et al. Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system. Nature. 448, 39-43 (2007).
- Roshan, R., et al. Brain-specific knockdown of miR-29 results in neuronal cell death and ataxia in mice. RNA. 20, 1287-1297 (2014).
- Kaur, H., Wengel, J., Maiti, S. Thermodynamics of DNA−RNA Heteroduplex Formation: Effects of Locked Nucleic Acid Nucleotides Incorporated into the DNA Strand. Biochemistry. 47, 1218-1227 (2008).
- Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., Van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Research. 34, D140-D144 (2006).
- Kaur, H., Babu, B. R., Maiti, S. Perspectives on Chemistry and Therapeutic Applications of Locked Nucleic Acid (LNA). Chemical Reviews. 107, 4672-4697 (2007).
- Guyenet, S. J., et al. A Simple Composite Phenotype Scoring System for Evaluating Mouse Models of Cerebellar Ataxia. J. Vis. Exp. (39), (2010).
- Bergen, J. M., Park, I. -. K., Horner, P. J., Pun, S. H. Nonviral Approaches for Neuronal Delivery of Nucleic Acids. Pharmaceutical Research. 25, 983-998 (2008).
- Zou, L. -. L., Ma, J. -. L., Wang, T., Yang, T. -. B., Liu, C. -. B. Cell-Penetrating Peptide-Mediated Therapeutic Molecule Delivery into the Central Nervous System. Current Neuropharmacology. 11, 197-208 (2013).
- Hwang, D. W., et al. A brain-targeted rabies virus glycoprotein-disulfide linked PEI nanocarrier for delivery of neurogenic microRNA. Biomaterials. 32, 4968-4975 (2011).
