Electrotaxis Studier af lungecancerceller ved hjælp af en Multichannel Dual-elektriske-felt Mikrofluid Chip
Summary
Many microfluidic devices have been developed for use in the study of electrotaxis. Yet, none of these chips allows the efficient study of the simultaneous chemical and electric-field (EF) effects on cells. We developed a polymethylmethacrylate-based device that offers better-controlled coexisting EF and chemical stimulation for use in electrotaxis research.
Abstract
Opførslen af retningsbestemt cellemigration under en jævnstrøm elektrisk-felt (dcEF) omtales som electrotaxis. Den betydelige rolle fysiologisk dcEF vejlede celle bevægelse under udvikling embryo, celledifferentiering og sårheling er blevet påvist i mange undersøgelser. Ved at anvende mikrofluide chips til en electrotaxis assay, er undersøgelsen proces forkortes og eksperimentelle fejl minimeres. I de senere år mikrofluidenheder fremstillet af polymere stoffer (f.eks polymethylmethacrylat, PMMA eller acryl) eller polydimethylsiloxan (PDMS) er ofte blevet brugt til at studere reaktionerne af celler til elektrisk stimulation. Men i modsætning til de talrige trin, der kræves til at fremstille en PDMS enhed, den enkle og hurtige konstruktion af akryl mikro fl uidic chip gør den velegnet til både enheden prototyping og produktion. Men ingen af de rapporterede enheder letter effektiv undersøgelse af den samtidige kemiske og DCEF virkninger på celler. I denne rapport beskriver vi vores design og fremstilling af en acrylbaseret multikanal dual-elektrisk-felt (MDF) chip til at undersøge den samtidige effekt af kemiske og elektrisk stimulation på lunge- kræftceller. MDF-chip giver otte kombinationer af elektriske / kemiske stimulationer i en enkelt test. Chippen ikke blot i høj grad forkorter den nødvendige eksperimentelle tidspunkt, men øger også nøjagtighed i electrotaxis undersøgelser.
Introduction
Adfærd adhærente celler bevæger sig mod en anode eller katode under en jævnstrøm elektrisk felt (dcEF) omtales som electrotaxis. Den electrotactic adfærd celler spiller en væsentlig rolle i embryogenese, nerveregenerering og sårheling. 1 Tumorceller, såsom rotte prostatacancerceller, 2 brystcancerceller, 3 og lungeadenokarcinom celler 4-8 har vist electrotactic bevægelse under et påført dcEF . Den fysiologiske EF er målt i kirtel væv. 9,10 Electrotaxis er også blevet rapporteret i kirtel-associerede tumorceller. 2,3 Samlet set electrotaxis af kræftceller anses for at være en metastase faktor. 11 Styring af elektriske vejledning af cancerceller under dcEF kan være en potentiel strategi for den fremtidige behandling af cancer. Men i dag, den detaljerede molekylære mekanisme electrotaxis forbliver kontroversiel. Derfor er en undersøgelse af influence af elektrisk stimulation på kræft celle migration kan lette udviklingen af strategier for kræftbehandling.
For nylig har bio-mikrofluidenheder blevet fremstillet for at studere cellulære responser til at flyde forskydningskraft, 12 kemiske gradienter, 13 og elektriske stimuli 4 in vitro. Fremstilling af bio-mikrofluidenheder hjælp polydimethylsiloxan (PDMS) eller polymethylmethacrylat (PMMA, også kendt som acryl) har med succes reduceret fejlprocent med sådanne forsøg. Endvidere betyder anvendelsen af acrylbaserede mikrofluidenheder som en prototype til undersøgelse af biologiske emner er enklere end at bruge PDMS chips. Forskellige funktioner i acrylbaserede enheder er blevet udviklet til electrotaxis undersøgelse. Men ingen af de tidligere designs er i stand til samtidigt at teste effekterne af forskellige kemiske forhold og det elektriske felt på celler for electrotaxis undersøgelse. Således har vi udviklet en mikrofluidanordning-multichannel dobbelt elektrisk felt (MDF) chip-holdige fire uafhængige kanaler kultur og otte forskellige eksperimentelle betingelser i en chip.
Den acrylbaseret MDF-chip, først rapporteret af Hou et al., 8 integrerer elektrisk stimulation og flere kemisk isolerede kanaler. Disse kemisk isoleret kanaler kan anvendes til dyrkning forskellige typer af celler i et eksperiment. Den dcEF i kanalerne er produceret af en elektrisk strømforsyning. To uafhængige elektriske felter, et med anvendt elektrisk-feltstyrke (EFS), og en anden med 0 EFS, er i hvert kemisk isoleret kanal. På denne måde chippen giver bedre styret sameksisterende EF og kemisk stimulering. Endvidere resultater fra numerisk simulering af den kemiske diffusion inde i MDF chip angiver, at ingen krydskontaminering fandt sted mellem kanalerne efter en 24 timers forsøgsperiode. 8
I forhold til device rapporteret af Li et al., 14 MDF chip giver et større kulturområde, der giver mulighed for yderligere biokemisk analyse af de elektrisk stimulerede celler. Derudover, med MDF chip større observation område, flere celler kan observeres i testen, så analysen af migration hastighed eller rettethed af de elektrisk stimulerede celler er mere præcis. Single-channel chip design af tidligere undersøgelser rapporteret af Huang et al. 4 og Tsai et al. 15 tillader kun én celletype eller kemikalie, der skal testes. Imidlertid kan MDF chip anvendes til at undersøge virkningerne af forskellige kemikalier på electrotaxis, samt virkningerne af elektrisk stimulering på forskellige celletyper. Med andre ord, MDF chip muliggør effektiv undersøgelse af kemiske dosis afhængigheder.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi fandt processen med vedhængende akryl adaptere på Lag 1 af MDF chip til at være en vanskelig opgave. Anvendelsen af kun 1 til 2 pi superlim er tilstrækkelig til at klæbe fast adapteren på MDF chip. Større mængder af lim resulterede i en ufuldstændig polymerisation af superlim og manglende overholdelse. Når acryl adaptorer klæbet fast på MDF chip, væskelækage i mikrofluidsystem sjældent forekom. Desuden O / N inkubation i vakuumkammeret bidraget til at fjerne luften fanget mellem dobbeltklæbende …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is financially supported by the Ministry of Science and Technology, Taiwan (Contract no. MOST 103-2113-M-001 -003 -MY2) and the Research Program on Nanoscience and Nanotechnology, Academia Sinica, Taiwan.
Materials
| Reagent | |||
| DMEM medium | Gibco,Invitrogen, USA | 12800-017 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco,Invitrogen, USA | 16000-044 | |
| Trypsin | Gibco,Invitrogen, USA | 25200-072 | |
| PBS | Basic Life | BL2651 | |
| Y-27632 (hydrochloride) | Cayman Chemical Co | 10005583 | |
| agarose | LONZO, USA | SeaKem LE AGAROSE | |
| syringe | Terumo | 3 ml with Luer taper | |
| 3-way stopcock | Nipro | with Luer taper | |
| PMMA (acrylic) | HiShiRon Industries CO., Ltd, Taiwan | thickness 1mm, 2mm | |
| acrylic adaptor | KuanMin Technology Co., Ltd, Taichung, Taiwan | 1/4-28 port, 10x10x6 mm | customized |
| nut | Thermo Fisher Scientific Inc. | UPCHURCH:P-206x, P-200x, F120x, P-659, P-315x | |
| Microscope cover glass | Deckgläser, Germany | 24×60 mm | |
| double-sided tape | 3M | PET 8018 | |
| super glue | 3M | Scotch Liquid Plus Super Glue | |
| Teflon tube | HENG YI ENTERPRISE CO., LTD., Taiwan | UPTB_06, DUPONT TEFLON BRAND RESIN FEP TUBING | outer diameter 1/16 in., inner diameter 0.03 in.; Upchurch Scientific |
| TFD4 detergent | Franklab, France | TFD4 | |
| ultrasonic steri cleaner | LEO ULTRASONIC CO., LTD., Taiwan | ||
| Thermo bonder | KuanMin Technology Co., Ltd, Taichung, Taiwan | customized | |
| CO2 laser scriber | LTT group, Taiwan | ISL-II | |
| indium tin oxide glass (ITO glass) | AimCore Technology Co., Ltd | TN/STN, ≦10Ω | |
| proportional-integral-derivative (PID) controller | JETEC Electronics Co., Japen | TTM-J40-R-AB, | |
| K-type thermocouple | TECPEL | TPK-02A | |
| 4-channel syringe pump | KdScientific, USA | 250P | |
| DC power supply | GWInstek, Taiwan | ||
| X-Y-Z motor stage | TanLian, E-O Co. Ltd., Taiwan | customized | |
| inverted microscope | Olympus, Japan | CKX41 | |
| digital SLR camera | Canon, Japan | 60D |
References
- McCaig, C. D., Rajnicek, A. M., Song, B., Zhao, M. Controlling cell behavior electrically: current views and future potential. Physiol Rev. 85, 943-978 (2005).
- Djamgoz, M. B. A., Mycielska, M., Madeja, Z., Fraser, S. P., Korohoda, W. Directional movement of rat prostate cancer cells in direct-current electric field: involvement of voltagegated Na+ channel activity. J Cell Sci. 114, 2697-2705 (2001).
- Pu, J., et al. EGF receptor signaling is essential for electric-field-directed migration of breast cancer cells. J Cell Sci. 120, 3395-3403 (2007).
- Huang, C. W., Cheng, J. Y., Yen, M. H., Young, T. H. Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip. Biosens Bioelectron. 24, 3510-3516 (2009).
- Huang, C. W., et al. Gene expression of human lung cancer cell line CL1-5 in response to a direct current electric field. PLoS One. 6, e25928 (2011).
- Sun, Y. S., Peng, S. W., Lin, K. H., Cheng, J. Y. Electrotaxis of lung cancer cells in ordered three-dimensional scaffolds. Biomicrofluidics. 6, 14102-1410214 (2012).
- Tsai, H. F., et al. Evaluation of EGFR and RTK signaling in the electrotaxis of lung adenocarcinoma cells under direct-current electric field stimulation. PLoS One. 8, e73418 (2013).
- Hou, H. S., Tsai, H. F., Chiu, H. T., Cheng, J. Y. Simultaneous chemical and electrical stimulation on lung cancer cells using a multichannel-dual-electric-field chip. Biomicrofluidics. 8, (2014).
- Faupel, M., et al. Electropotential evaluation as a new technique for diagnosing breast lesions. Eur J Radiol. 24, 33-38 (1997).
- Szatkowski, M., Mycielska, M., Knowles, R., Kho, A. L., Djamgoz, M. B. Electrophysiological recordings from the rat prostate gland in vitro: identified single-cell and transepithelial (lumen) potentials. BJU Int. 86, 1068-1075 (2000).
- McCaig, C. D., Song, B., Rajnicek, A. M. Electrical dimensions in cell science. J Cell Sci. 122, 4267-4276 (2009).
- Das, T., Maiti, T. K., Chakraborty, S. Traction force microscopy on-chip: shear deformation of fibroblast cells. Lab Chip. 8, 1308-1318 (2008).
- Lin, F., Butcher, E. C. T cell chemotaxis in a simple microfluidic device. Lab Chip. 6, 1462-1469 (2006).
- Li, J., Zhu, L., Zhang, M., Lin, F. Microfluidic device for studying cell migration in single or co-existing chemical gradients and electric fields. Biomicrofluidics. 6, 24121-2412113 (2012).
- Tsai, H. F., Peng, S. W., Wu, C. Y., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis of oral squamous cell carcinoma cells in a multiple-electric-field chip with uniform flow field. Biomicrofluidics. 6, 34116 (2012).
- Cheng, J. Y., Wei, C. W., Hsu, K. H., Young, T. H. Direct-write laser micromachining and universal surface modification of PMMA for device development. Sensors and Actuators B: Chemical. 99, 186-196 (2004).
- Chu, Y. W., et al. Selection of invasive and metastatic subpopulations from a human lung adenocarcinoma cell line. Am J Respir Cell Mol Biol. 17, 353-360 (1997).
- Cheng, J. Y., Yen, M. H., Kuo, C. T., Young, T. H. A transparent cell-culture microchamber with a variably controlled concentration gradient generator and flow field rectifier. Biomicrofluidics. 2, 24105 (2008).
- Cheng, J. -. Y., Yen, M. -. H., Hsu, W. -. C., Jhang, J. -. H., Young, T. -. H. ITO patterning by a low power Q-switched green laser and its use in the fabrication of a transparent flow meter. Journal of Micromechanics and Microengineering. 17, 2316 (2007).
- Pu, J., Zhao, M. Golgi polarization in a strong electric field. J Cell Sci. 118, 1117-1128 (2005).
- Zhao, M., Bai, H., Wang, E., Forrester, J. V., McCaig, C. D. Electrical stimulation directly induces pre-angiogenic responses in vascular endothelial cells by signaling through VEGF receptors. J Cell Sci. 117, 397-405 (2004).
- Yao, L., Shanley, L., McCaig, C., Zhao, M. Small applied electric fields guide migration of hippocampal neurons. J Cell Physiol. 216, 527-535 (2008).
