Électrotaxie l'étude des cellules du cancer du poumon à l'aide d'un double-Multichannel champ électrique microfluidique Chip
Summary
Many microfluidic devices have been developed for use in the study of electrotaxis. Yet, none of these chips allows the efficient study of the simultaneous chemical and electric-field (EF) effects on cells. We developed a polymethylmethacrylate-based device that offers better-controlled coexisting EF and chemical stimulation for use in electrotaxis research.
Abstract
Le comportement de la migration cellulaire directionnelle sous un champ électrique à courant continu (dCEF) est désigné comme électrotaxie. Le rôle physiologique important de dCEF à guider le mouvement des cellules pendant le développement embryonnaire, la différenciation cellulaire et la cicatrisation des plaies a été démontré dans de nombreuses études. En appliquant puces microfluidiques à un essai de électrotaxie, le processus d'enquête est raccourcie et les erreurs expérimentales sont minimisés. Ces dernières années, des dispositifs microfluidiques fabriqués avec des matériaux polymères (par exemple, le polyméthacrylate de méthyle, PMMA, acrylique ou) ou du polydiméthylsiloxane (PDMS) ont été largement utilisés dans l'étude des réponses des cellules à une stimulation électrique. Toutefois, contrairement aux nombreuses étapes nécessaires pour fabriquer un dispositif de PDMS, la construction simple et rapide des micro acryliques fl uidique puce rend approprié à la fois pour le prototypage et la production de l'appareil. Pourtant, aucun des appareils déclarés de faciliter l'étude efficace de la chimique et dcE simultanéeF effets sur les cellules. Dans ce rapport, nous décrivons notre conception et la fabrication d'un double champ électrique multicanaux à base d'acrylique (MDF) à puce pour étudier l'effet simultané de produits chimiques et la stimulation électrique sur des cellules de cancer du poumon. La puce MDF fournit huit combinaisons de stimulations électriques / chimiques dans un seul test. La puce non seulement raccourcit considérablement le temps nécessaire expérimentale, mais augmente également la précision dans électrotaxie études.
Introduction
Le comportement des cellules adhérentes qui se déplacent en direction d'une anode ou de la cathode sous un champ électrique de courant continu (dCEF) est appelée électrotaxie. Le comportement electrotactic de cellules joue un rôle important dans l'embryogenèse, la régénération des nerfs, et la cicatrisation des plaies. 1 Des cellules tumorales telles que des cellules cancéreuses de la prostate de rat, des cellules cancéreuses deux mammaires, 3 et pulmonaires cellules d'adénocarcinome 4-8 ont montré mouvement electrotactic sous une dCEF appliqué . L'EF physiologique a été mesurée dans les tissus de la glande. 9,10 électrotaxie a également été signalé dans les cellules tumorales des glandes associées. 2,3 Pris ensemble, les électrotaxie de cellules cancéreuses est considéré comme un facteur de métastases. 11 Contrôle de la direction électrique les cellules cancéreuses sous dCEF peuvent être une approche potentielle pour le traitement futur du cancer. Cependant, aujourd'hui, le mécanisme moléculaire détaillé de électrotaxie reste controversée. Par conséquent, une enquête de l'influence de la stimulation électrique sur la migration des cellules cancéreuses peut faciliter le développement de stratégies pour le traitement du cancer.
Récemment, des dispositifs bio-microfluidique ont été fabriqués pour l'étude des réponses cellulaires à couler force de cisaillement, 12 gradients chimiques, 13 et électrique 4 stimuli in vitro. La fabrication de dispositifs de bio-microfluidique utilisant (PDMS) ou polyméthacrylate de méthyle (PMMA, aussi connu comme l'acrylique) a réussi à réduire le taux de ces expériences d'échec. En outre, en utilisant des dispositifs microfluidiques à base d'acrylique comme un prototype pour enquêter sur des sujets biologiques est plus simple que d'utiliser des copeaux de PDMS. Diverses fonctions dans les dispositifs à base d'acrylique ont été développés pour électrotaxie étude. Cependant, aucune des conceptions antérieures sont capables de tester simultanément les effets de diverses conditions chimiques et le champ électrique sur-cellules pour électrotaxie étude. Ainsi, nous avons développé un dispositif microfluidique mu-leltichannel double champ électrique (MDF) quatre canaux culturels indépendants et huit conditions expérimentales différentes dans une puce contenant puce.
La puce de MDF à base d'acrylique, d'abord rapporté par Hou et al., 8 intègre une stimulation électrique et plusieurs canaux isolés chimiquement. Ces canaux isolés chimiquement peuvent être utilisés pour la culture de différents types de cellules dans une expérience. Le dCEF dans les canaux est produite par une source d'alimentation électrique. Deux champs électriques indépendantes, l'une avec une force appliquée de champ électrique (EFS) et l'autre avec 0 EFS, sont menées dans chaque canal chimiquement isolé. De cette manière, la puce fournit EF coexistante mieux contrôlée et la stimulation chimique. En outre, les résultats de la simulation numérique de la diffusion de produits chimiques à l'intérieur de la puce MDF indiquent qu'aucune contamination croisée entre les canaux est survenue après une période expérimentale de 24 heures. 8
Par rapport à la DeviCE rapporté par Li et al., 14 la puce MDF fournit une zone de grande culture, qui permet une plus grande analyse biochimique des cellules stimulées électriquement. En outre, avec une plus grande zone d'observation de la puce MDF, plusieurs cellules peuvent être observées dans le test, si l'analyse de la vitesse de migration ou directedness des cellules stimulées électriquement est plus précis. Les monocanal puce conceptions d'études antérieures rapportés par Huang et al. 4 et Tsai et al. 15 ne permettent qu'un seul type de cellule ou chimique à tester. Cependant, la puce de MDF peut être utilisé pour étudier les effets de différents produits chimiques sur la électrotaxie, ainsi que les effets de la stimulation électrique sur différents types de cellules. En d'autres termes, la puce MDF permet l'étude efficace de dépendances de doses chimiques.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous avons trouvé le processus d'adhésion adaptateurs acryliques sur la couche 1 de la puce MDF à être difficile. L'application de seulement 1 à 2 pi de super glue est suffisante pour faire adhérer fermement l'adaptateur sur la puce MDF. De plus grandes quantités de colle ont abouti à une polymérisation incomplète de la super glue et l'échec à adhérer. Une fois que les adaptateurs acryliques ont été fermement collées sur la puce MDF, une fuite de liquide dans le système microfluidique ra…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is financially supported by the Ministry of Science and Technology, Taiwan (Contract no. MOST 103-2113-M-001 -003 -MY2) and the Research Program on Nanoscience and Nanotechnology, Academia Sinica, Taiwan.
Materials
| Reagent | |||
| DMEM medium | Gibco,Invitrogen, USA | 12800-017 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco,Invitrogen, USA | 16000-044 | |
| Trypsin | Gibco,Invitrogen, USA | 25200-072 | |
| PBS | Basic Life | BL2651 | |
| Y-27632 (hydrochloride) | Cayman Chemical Co | 10005583 | |
| agarose | LONZO, USA | SeaKem LE AGAROSE | |
| syringe | Terumo | 3 ml with Luer taper | |
| 3-way stopcock | Nipro | with Luer taper | |
| PMMA (acrylic) | HiShiRon Industries CO., Ltd, Taiwan | thickness 1mm, 2mm | |
| acrylic adaptor | KuanMin Technology Co., Ltd, Taichung, Taiwan | 1/4-28 port, 10x10x6 mm | customized |
| nut | Thermo Fisher Scientific Inc. | UPCHURCH:P-206x, P-200x, F120x, P-659, P-315x | |
| Microscope cover glass | Deckgläser, Germany | 24×60 mm | |
| double-sided tape | 3M | PET 8018 | |
| super glue | 3M | Scotch Liquid Plus Super Glue | |
| Teflon tube | HENG YI ENTERPRISE CO., LTD., Taiwan | UPTB_06, DUPONT TEFLON BRAND RESIN FEP TUBING | outer diameter 1/16 in., inner diameter 0.03 in.; Upchurch Scientific |
| TFD4 detergent | Franklab, France | TFD4 | |
| ultrasonic steri cleaner | LEO ULTRASONIC CO., LTD., Taiwan | ||
| Thermo bonder | KuanMin Technology Co., Ltd, Taichung, Taiwan | customized | |
| CO2 laser scriber | LTT group, Taiwan | ISL-II | |
| indium tin oxide glass (ITO glass) | AimCore Technology Co., Ltd | TN/STN, ≦10Ω | |
| proportional-integral-derivative (PID) controller | JETEC Electronics Co., Japen | TTM-J40-R-AB, | |
| K-type thermocouple | TECPEL | TPK-02A | |
| 4-channel syringe pump | KdScientific, USA | 250P | |
| DC power supply | GWInstek, Taiwan | ||
| X-Y-Z motor stage | TanLian, E-O Co. Ltd., Taiwan | customized | |
| inverted microscope | Olympus, Japan | CKX41 | |
| digital SLR camera | Canon, Japan | 60D |
References
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