Electrotaxis Studies van longkanker-cellen met behulp van een Multichannel Dual-elektrisch veld Microfluïdische Chip
Summary
Many microfluidic devices have been developed for use in the study of electrotaxis. Yet, none of these chips allows the efficient study of the simultaneous chemical and electric-field (EF) effects on cells. We developed a polymethylmethacrylate-based device that offers better-controlled coexisting EF and chemical stimulation for use in electrotaxis research.
Abstract
Het gedrag van gerichte celmigratie onder een gelijkstroom elektrisch veld (dcEF) wordt genoemd electrotaxis. De belangrijke rol van fysiologische dcEF in het begeleiden cel beweging tijdens embryonale ontwikkeling, celdifferentiatie en wondgenezing is aangetoond in vele studies. Door het toepassen van microfluïdische chips met een electrotaxis assay, wordt het onderzoek proces verkort en experimentele fouten worden geminimaliseerd. In de afgelopen jaren, microfluïdische inrichtingen van polymere stoffen (bijvoorbeeld polymethylmethacrylaat, PMMA of acryl) of polydimethylsiloxaan (PDMS) zijn op grote schaal gebruikt bij het bestuderen van de reacties van cellen op elektrische stimulatie. Anders dan de talrijke stappen vereist om een PDMS apparaat fabriceren, de eenvoudige en snelle opbouw van de acryl- micro fl uidic chip maakt het geschikt voor zowel inrichting prototyping en productie. Geen van de vermelde inrichtingen vergemakkelijken efficiënte studie van gelijktijdige chemische en DCEF effecten op cellen. In dit verslag beschrijven we ons ontwerp en fabricage van een acrylbasis multichannel dual-elektrisch-veld (MDF) chip om het gelijktijdige effect van chemische en elektrische stimulering van longkankercellen onderzoeken. De MDF-chip biedt acht combinaties van elektrische / chemische stimulaties in een enkele test. De chip niet alleen sterk verkort de vereiste experimentele tijd, maar verhoogt ook de nauwkeurigheid in electrotaxis studies.
Introduction
Het gedrag van hechtende cellen bewegen naar een anode en kathode onder een gelijkstroom elektrisch veld (dcEF) wordt genoemd electrotaxis. De electrotactic gedrag van cellen speelt een belangrijke rol bij embryogenese, zenuwregeneratie en wondgenezing. 1 Tumorcellen zoals ratten prostaatkankercellen, borstkankercellen 2, 3 en longadenocarcinoom cellen 4-8 gebleken electrotactic beweging onder een aangebrachte dcEF . De fysiologische EF is gemeten klier weefsels. 9,10 Electrotaxis is ook gerapporteerd in klier-geassocieerde tumorcellen. 2,3 genomen samen de electrotaxis van kankercellen wordt beschouwd als een metastase factor. 11 beheersen van de elektrische leiding van kankercellen onder dcEF kan een potentiële benadering voor de toekomstige behandeling van kanker. Echter, vandaag de gedetailleerde moleculaire mechanisme van electrotaxis blijft controversieel. Daarom is een onderzoek naar de influence van elektrische stimulatie op kankercel migratie kan de ontwikkeling van strategieën voor de behandeling van kanker te vergemakkelijken.
Recent zijn bio-microfluïdische inrichtingen vervaardigd voor het bestuderen van cellulaire reacties op schuifkracht stroomt, 12 chemische gradiënten, 13 en elektrische stimuli 4 in vitro. De vervaardiging van bio-microfluïdische apparaten met polydimethylsiloxaan (PDMS) of polymethylmethacrylaat (PMMA, ook bekend als acryl) met succes verlaagd percentage mislukkingen van dergelijke experimenten. Bovendien gebruiken acrylbasis microfluïdische inrichtingen als een prototype voor het onderzoeken van biologische onderwerpen is eenvoudiger dan het gebruik PDMS chips. Verschillende functies acrylbasis inrichtingen ontwikkeld voor electrotaxis studie. Echter, geen van deze ontwerpen kunnen gelijktijdig testen van de effecten van verschillende chemische omstandigheden en het elektrisch veld op cellen electrotaxis studie. Zo ontwikkelden we een microfluïdische apparaat-de multichannel dual-elektrische veld (MDF) chip met vier onafhankelijke cultuur kanalen en acht verschillende experimentele condities in een chip.
De acrylbasis MDF chip, eerst beschreven door Hou et al., 8 integreert elektrische stimulatie en verschillende chemisch gescheiden kanalen. Deze chemisch gescheiden kanalen kan worden gebruikt om de cultuur verschillende typen cellen in een experiment. De dcEF in de kanalen wordt geproduceerd door een elektrische voeding. Twee onafhankelijke elektrische velden, één met toegepaste elektrische veldsterkte (EFS) en een andere met 0 EFS, worden uitgevoerd in elk chemisch geïsoleerde kanaal. Op deze manier wordt de chip levert beter gecontroleerde coëxisteerende EF en chemische stimulatie. Bovendien, de resultaten van de numerieke simulatie van de chemische diffusie in de MDF-chip aan te geven dat er geen kruisbesmetting plaatsgevonden tussen de kanalen na een 24 uur experimentele periode. 8
Vergeleken met de Device beschreven door Li et al., 14 MDF chip levert een grotere cultuur gebied, waardoor verdere biochemische analyse van de elektrisch gestimuleerde cellen. Bovendien, met grotere observatiegebied MDF chip, meer cellen kunnen worden waargenomen in de test, zodat de analyse van de migratie snelheid of gerichtheid van de elektrisch gestimuleerde cellen nauwkeuriger. De enkelkanaals chip designs eerdere studies beschreven door Huang et al. 4 en Tsai et al. 15 staan slechts één type cel of chemische te testen. Echter, de MDF chip worden gebruikt om de effecten van verschillende chemicaliën op electrotaxis, evenals de effecten van elektrische stimulering van verschillende typen cellen te onderzoeken. Met andere woorden, de MDF chip maakt efficiënte studie van chemische afhankelijkheden dosis.
Protocol
Representative Results
Discussion
We vonden dat het proces van hechtende acryl adapters op Laag 1 van de MDF-chip lastig te zijn. De toepassing van slechts 1 tot 2 pl superlijm voldoende stevig hechten van de adapter op de MDF chip. Grotere hoeveelheden lijm leidde tot een onvolledige polymerisatie van superlijm en niet hechten. Zodra het acryl adapters stevig werden vastgehouden op de MDF-chip, vloeistof lekkage in de microfluïdische systeem zelden voorgekomen. Daarnaast, O / N incubatie in de vacuümkamer hielp om de lucht gevangen tussen de dubbelzi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is financially supported by the Ministry of Science and Technology, Taiwan (Contract no. MOST 103-2113-M-001 -003 -MY2) and the Research Program on Nanoscience and Nanotechnology, Academia Sinica, Taiwan.
Materials
| Reagent | |||
| DMEM medium | Gibco,Invitrogen, USA | 12800-017 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco,Invitrogen, USA | 16000-044 | |
| Trypsin | Gibco,Invitrogen, USA | 25200-072 | |
| PBS | Basic Life | BL2651 | |
| Y-27632 (hydrochloride) | Cayman Chemical Co | 10005583 | |
| agarose | LONZO, USA | SeaKem LE AGAROSE | |
| syringe | Terumo | 3 ml with Luer taper | |
| 3-way stopcock | Nipro | with Luer taper | |
| PMMA (acrylic) | HiShiRon Industries CO., Ltd, Taiwan | thickness 1mm, 2mm | |
| acrylic adaptor | KuanMin Technology Co., Ltd, Taichung, Taiwan | 1/4-28 port, 10x10x6 mm | customized |
| nut | Thermo Fisher Scientific Inc. | UPCHURCH:P-206x, P-200x, F120x, P-659, P-315x | |
| Microscope cover glass | Deckgläser, Germany | 24×60 mm | |
| double-sided tape | 3M | PET 8018 | |
| super glue | 3M | Scotch Liquid Plus Super Glue | |
| Teflon tube | HENG YI ENTERPRISE CO., LTD., Taiwan | UPTB_06, DUPONT TEFLON BRAND RESIN FEP TUBING | outer diameter 1/16 in., inner diameter 0.03 in.; Upchurch Scientific |
| TFD4 detergent | Franklab, France | TFD4 | |
| ultrasonic steri cleaner | LEO ULTRASONIC CO., LTD., Taiwan | ||
| Thermo bonder | KuanMin Technology Co., Ltd, Taichung, Taiwan | customized | |
| CO2 laser scriber | LTT group, Taiwan | ISL-II | |
| indium tin oxide glass (ITO glass) | AimCore Technology Co., Ltd | TN/STN, ≦10Ω | |
| proportional-integral-derivative (PID) controller | JETEC Electronics Co., Japen | TTM-J40-R-AB, | |
| K-type thermocouple | TECPEL | TPK-02A | |
| 4-channel syringe pump | KdScientific, USA | 250P | |
| DC power supply | GWInstek, Taiwan | ||
| X-Y-Z motor stage | TanLian, E-O Co. Ltd., Taiwan | customized | |
| inverted microscope | Olympus, Japan | CKX41 | |
| digital SLR camera | Canon, Japan | 60D |
References
- McCaig, C. D., Rajnicek, A. M., Song, B., Zhao, M. Controlling cell behavior electrically: current views and future potential. Physiol Rev. 85, 943-978 (2005).
- Djamgoz, M. B. A., Mycielska, M., Madeja, Z., Fraser, S. P., Korohoda, W. Directional movement of rat prostate cancer cells in direct-current electric field: involvement of voltagegated Na+ channel activity. J Cell Sci. 114, 2697-2705 (2001).
- Pu, J., et al. EGF receptor signaling is essential for electric-field-directed migration of breast cancer cells. J Cell Sci. 120, 3395-3403 (2007).
- Huang, C. W., Cheng, J. Y., Yen, M. H., Young, T. H. Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip. Biosens Bioelectron. 24, 3510-3516 (2009).
- Huang, C. W., et al. Gene expression of human lung cancer cell line CL1-5 in response to a direct current electric field. PLoS One. 6, e25928 (2011).
- Sun, Y. S., Peng, S. W., Lin, K. H., Cheng, J. Y. Electrotaxis of lung cancer cells in ordered three-dimensional scaffolds. Biomicrofluidics. 6, 14102-1410214 (2012).
- Tsai, H. F., et al. Evaluation of EGFR and RTK signaling in the electrotaxis of lung adenocarcinoma cells under direct-current electric field stimulation. PLoS One. 8, e73418 (2013).
- Hou, H. S., Tsai, H. F., Chiu, H. T., Cheng, J. Y. Simultaneous chemical and electrical stimulation on lung cancer cells using a multichannel-dual-electric-field chip. Biomicrofluidics. 8, (2014).
- Faupel, M., et al. Electropotential evaluation as a new technique for diagnosing breast lesions. Eur J Radiol. 24, 33-38 (1997).
- Szatkowski, M., Mycielska, M., Knowles, R., Kho, A. L., Djamgoz, M. B. Electrophysiological recordings from the rat prostate gland in vitro: identified single-cell and transepithelial (lumen) potentials. BJU Int. 86, 1068-1075 (2000).
- McCaig, C. D., Song, B., Rajnicek, A. M. Electrical dimensions in cell science. J Cell Sci. 122, 4267-4276 (2009).
- Das, T., Maiti, T. K., Chakraborty, S. Traction force microscopy on-chip: shear deformation of fibroblast cells. Lab Chip. 8, 1308-1318 (2008).
- Lin, F., Butcher, E. C. T cell chemotaxis in a simple microfluidic device. Lab Chip. 6, 1462-1469 (2006).
- Li, J., Zhu, L., Zhang, M., Lin, F. Microfluidic device for studying cell migration in single or co-existing chemical gradients and electric fields. Biomicrofluidics. 6, 24121-2412113 (2012).
- Tsai, H. F., Peng, S. W., Wu, C. Y., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis of oral squamous cell carcinoma cells in a multiple-electric-field chip with uniform flow field. Biomicrofluidics. 6, 34116 (2012).
- Cheng, J. Y., Wei, C. W., Hsu, K. H., Young, T. H. Direct-write laser micromachining and universal surface modification of PMMA for device development. Sensors and Actuators B: Chemical. 99, 186-196 (2004).
- Chu, Y. W., et al. Selection of invasive and metastatic subpopulations from a human lung adenocarcinoma cell line. Am J Respir Cell Mol Biol. 17, 353-360 (1997).
- Cheng, J. Y., Yen, M. H., Kuo, C. T., Young, T. H. A transparent cell-culture microchamber with a variably controlled concentration gradient generator and flow field rectifier. Biomicrofluidics. 2, 24105 (2008).
- Cheng, J. -. Y., Yen, M. -. H., Hsu, W. -. C., Jhang, J. -. H., Young, T. -. H. ITO patterning by a low power Q-switched green laser and its use in the fabrication of a transparent flow meter. Journal of Micromechanics and Microengineering. 17, 2316 (2007).
- Pu, J., Zhao, M. Golgi polarization in a strong electric field. J Cell Sci. 118, 1117-1128 (2005).
- Zhao, M., Bai, H., Wang, E., Forrester, J. V., McCaig, C. D. Electrical stimulation directly induces pre-angiogenic responses in vascular endothelial cells by signaling through VEGF receptors. J Cell Sci. 117, 397-405 (2004).
- Yao, L., Shanley, L., McCaig, C., Zhao, M. Small applied electric fields guide migration of hippocampal neurons. J Cell Physiol. 216, 527-535 (2008).
