Micropost Diziler Kolay ve Doğru Mekanik-profil

Summary

Described are protocols for quantifying mechanical interactions between adherent cells and microstructured substrates. These interactions are closely linked to essential cell behaviors including migration, proliferation, differentiation, and apoptosis. The protocols present an open-source image analysis software called MechProfiler, which enables determination of involved forces for each micropost.

Abstract

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate surroundings. Particularly, cell-substrate interactions are the main interest. Today micropost arrays are a well-characterized and established method with a broad range of applications that have been published over the last decade. However, there seems to be a reservation among biologists to adapt the technique due to the lengthy and challenging process of micropost manufacture along with the lack of easily approachable software for analyzing images of cells interacting with microposts.

The force read-out from microposts is surprisingly easy. A micropost acts like a spring with the cell ideally attached at its tip. Depending on size a cell applies force from its cytoskeleton through one or multiple focal adhesion points to the micropost, thus deflecting the micropost. The amount of deflection correlates directly to the applied force in direction and in magnitude. The number of microposts covered by a cell and the post deflection patterns are characteristic and allow determination of values like force per post and many biologically relevant parameters that allow “mechano-profiling” of cell phenotypes.

A convenient method for mechano-profiling is described here combining the first generation of ready-to-use commercially available microposts with an in-house developed software package that is now accessible to all researchers. As a demonstration of typical application, single images of bone cancer cells were taken in bright-field microscopy for mechano-profiling of cell line models of metastasis. This combination of commercial traction force sensors and open source software for analysis allows for the first time a rapid implementation of the micropost array technique into routine lab work done by non-expert users. Furthermore, a robust and streamlined analysis process enables a user to analyze a large number of micropost images in a highly time-efficient manner.

Introduction

Mekanik-duyarlı hücre bazlı deneyler mekaniği hücre biyolojisi oynayabileceği role yansıtan geniş bir uygulama yelpazesi ile, yapışık hücrelerin araştırmak için izin verir. Bu uygulamalar genellikle hücre içi süreçleri ya da tam hücreli davranışını sürücü altında yatan mekanizmalar odaklanın. Bir yandan, bu tür ekstra hücresel matris bileşiminin ya da matris sertlik gibi dış çevre faktörleri önemli ölçüde bir hücrenin mekanik ve biyolojik tepkiyi etkiler. ^1, aynı farmasötik olarak aktif bileşiklerin çoğu sınıflarının kullanımından sonra gözlenebilir, etkileri olan vardır genellikle hücre kültür modelleri kullanılarak karakterize edilmiştir. ² tür iskeleti yapısı ve fonksiyonu değişiklikler ile ilişkili hücre fenotipi işaretli değişiklikleri uyarabilir spontan veya deneysel genetik mutasyonların neden olduğu gibi diğer taraftan genotipik özellikleri üzerinde. ³ Bu örnekler vardır Birçok olası birkaçkonular hangi hücrelerin mekanik fenotiplendirilmesi ilgili olduğunu ve tüm bu yararlı micropost dizileri ile incelenmiştir.

Bu yazının yazıldığı, yaklaşık 200 makaleler hücre micropost etkileşimini anlatan yayınlanmıştır. Bu eserler micropost saptırma ilkeleri teorik yönlerini yanı sıra kendi imalatı pratik talimatlar tartışmak. Hücreler ve esnek micropost dizilerin etkileşimini anlatan ilk makale, sürekli yumuşak yüzeylerde Tan ve ark nanonewton ölçekli hücre kasılma, tahmin etmek için kullanılır, klasik çekme kuvvet mikroskobu (TFM) aksine 2003. ^4'te Tan ve arkadaşları tarafından yayımlandı. silikon elastomerden yapılmış çok yakın aralıklı dikey kirişler kullanılarak bir yöntem açıklamıştır. Bu tekniğin başlıca avantajları, iki ana özelliklerinden ortaya çıkmaktadır. Tutarken İlk hücre görünür substrat sertliği değiştirmek için yalnızca tek bir micropost boyutlarını değiştirmek gerekiyorAksi takdirde sürekli ve böylece yüzey topoloji ve kimya farklılıkları kaçınarak substrat bileşimi. İkinci microposts discretely bireysel odak yapışıklıklar sırasına kuvvet ve mekansal kararları ile analiz edilebilir ve standart TFM tarafından benzer analizler doğasında olan analitik zorlukları azaltabilir bireysel yaylar gibi hareket ederler.

Bugün micropost dizileri için uygulama aralığı büyük ölçüde birkaç tek hücreler için kuvvetlerin sadece haritalama aşıyor. Örneğin, Akiyama bir böcek kas gücünü bağımsız mikro robot geliştirmek amacıyla, bir micropost dizisi için bir harekete geçirici olarak güve tırtıl bir izole dorsal damar dokusu kullanımını bildirir. ⁵

Bununla birlikte, microposts en yayınlanmış başvurular enfeksiyon ya da kanser gibi tıbbi durumların çalışmalara yoğunlaşmıştır. Örneğin, micropost diziler Neisseria gonorrh ve paketlenmiş tip IV pili kuvvet nesil incelemek için kullanılmıştır. Sinyal kaskadları enfeksiyon artırılması ile ilişkili ⁶ Diğerleri hücre iskeleti hedefleyen ilaç bileşikleri ile tedavi meme kanseri hücrelerini incelemek için microposts kullandık OEA kolonileri. ⁷

Bir micropost sapması genellikle hücrenin varsayarak bir uç yük ile bir konsol için klasik ışın teorisi kullanılarak tarif edilir ancak micropost çok uç takılır. Bir saptırma ö neden İşte uygulanan kuvvet F micropost yönettiği "bükülme sertliği" k bağlıdır ve hesaplanır:

(1)

E, I, L ve varlık Young modülü, sırasıyla atalet ve kiriş uzunluğunun alan anı ile. Alt tabaka eğilmesi ac alınmadığı Ancak, bu denklemden sonuçlar sadece ışın kesme beri iş ve hem de eğilme kuvvetlerin genel yaklaşım vermeksaymak. Microposts tipik polidimetilsiloksan (PDMS) gibi yumuşak malzemelerden yapılmış olması dikkate alındığında bu faktörlerin dahil edilmesi gereken silikon kauçuk tabanlı. . Schoen ve arkadaşları micropost (L / D) ve karşılık gelen polimerin Poisson Oranı v oranına göre bir düzeltme faktörü olduğunu göstermiştir ⁸ O ile verilir.:

(2)

T _eğim (v) aynı maddede bulunabilir gibi uydurma parametre a = 1.3 içeren bir devirme katsayısı olma ile:

(3)

Bu bir micropost en düzeltilmiş sertlik k _corr saf eğilme sertliği k = k _viraj ürün ve düzeltme faktörü corr demektirtarafından verilen:

(4)

Bu nedenle, hücre kuvvet hesaplamaları şimdi okuma denklem (1) daha rafine varyasyon kullanılarak yapılmalıdır:

(5)

Düzeltme etkisi kısa sürede micropost boyutları için tipik değerler kullanılır gibi daha belirgin hale gelir. Örneğin, dairesel bir kesite ve PDMS bazlı silikon lastikten yapılmış 5 um'lik bir çapa sahip bir 15-mikronluk bir uzun micropost 0.77 bir düzeltme faktörü yol açar ve bu nedenle, düzeltilmemiş hesaplama% 23 tarafından uygulanan kuvvetleri hücre olduğundan fazla olacaktır. Bu daha şiddetli küçük boy oranları ile microposts için olur.

Geleneksel olarak, micropost görüntü analizi de idealize kiriş eğilme kuramına dayalı olmuştur. 2005 yılında MICR kullanımına öncülük grupOPOST diziler micropost analizi için uygun bir görüntü analiz yazılımı yayınlanan ⁹ yazılımı yazılım lisans gerektirir ve kullanıcı her pozisyon için üç görüntüleri almak zorundadır.; iletim modu ve lekeli hücre floresan modunda başka biri micropost üst ve alt uçakları birer. Her biri için üst ve alt pozisyonları karşılaştırarak sonra yazılım bir kuvvet vektör alanı belirler ve yazı başına kuvvet gibi ilgili parametreleri hesaplar micropost. Diğer yazılım paketleri var ve bunların analizleri prensipleri kısaca bunları açıklamak gelen maddelerde belirtilen, ancak bu analitik yazılım paketleri genellikle kamuya açık değildir. ^10,11

Eşleme hücre kuvvetleri için tasarlanmış micropost dizileri tüm komşu microposts arasında eşit mesafeli boşlukların avantajına sahip olan ikinci bir ortogonal micropost düzeni veya altıgen biri olmak ya da sınıflandırılabilir. Tipik microposts habir dairesel geçiş kısmına ziyaretinde ve boyutları oval ya da kare kesitli microposts de rapor edilmiştir, ancak uzunluğu 50 um ila 1,0 um çapında 10 um ve 2. ⁴ arasında değişir. ^12,13

Micropost malzemesi olarak PDMS bazlı silikon karışımlarının kullanılması karışımı içine nano-tanecikleri ilave sağlar. Kobalt nano çubuklar ekleyerek Örneğin micropost bir manyetik aktivasyon sağlayan ve böylece potansiyel deneysel tasarımlar özgürlük başka derecesini verir. ¹⁴ Çoğu grup kapak cam gibi veya Petri kabı içinde düz sert yüzeylerde kendi micropost dizileri üretmek. Bununla birlikte, Mann ve arkadaşları son bir gerilebilir zar üzerinde oluşturulmuş bir dizi micropost bildirmiştir. ^15, hücre kontraktilite açısından canlı hücre sub-hücresel dinamik yanıtları okurken bu yapışık hücreler hücre germe güçlerine uygulanmasını da mümkün kılar.

Yaygın olarak kullanılan ve çoğu estabSU8 fotorezist ile bir silikon gofret üstüne mikro üretmek için kullanılan temiz oda, kısa, standart işlemlerde SNIADECKI ve ark. ^16-18 arasında derinlemesine protokoller de tarif edildiği gibi micropost dizileri yapmak için yayımlanır işlemi, yumuşak litografi dayanmaktadır. Bu silikon kauçuk kalıplara aktarılması yapılar üzerinde döküm edildiği bir kopyalama işlemi ile takip edilir. İkinci bir aşamada, bu kalıplar, seçilen bir alt-tabaka üzerine bir silikon kauçuğun kullanımım başlangıç ​​mikro çoğaltmak için kullanılır. Ancak microposts için bir üretim sürecini kuran kendi uygulamasıyla ilgili yayınlar, büyük ve artan sayıda rağmen mikro mühendislik uzmanları için bile zaman önemli miktarda alır; kabul edilebilir bir kalite düzeyini elde etmek için belirli laboratuar ortamında ve micropost düzeni optimizasyon ve adaptasyon gerektiren birçok işlem basamakları vardır.

Ticari micropost dizileri hazır t artık mevcutsürekli yüksek kalite ile o-kullanım ("off-the-raf") biçimi. Bu nedenle onlar bünyesinde üretimi için gerekli olan karmaşık ve uzun üretim sürecinin bir alternatiftir. Bu yazıda, bir ticari olarak temin edilebilir micropost dizisi, tek bir aydınlık alan mikroskopi görüntü kullanılarak selüler kuvvetleri haritasını hazırlamak için kullanıldı. Daha da önemlisi, bu makalede açıklanan ve bu yazının tamamlayıcı malzeme olarak yüklenebilir MechProfiler adında bir tam fonksiyonlu açık kaynak yazılımlar, belgelemektedir. Yazılımın bir aktif tutulan versiyonu da http://www.orthobiomech.ethz.ch adresinde bulunabilir.

Bir "off-the-raf" tahlil ve uyumlu bir açık kaynak analiz yazılımı kombinasyonu belirgin doğru TFM deneyler gerçekleştirmek için giriş engel düşürür. Temiz oda tesisleri veya yazılım geliştirme uzmanlığı ya erişimi olmayan araştırmacılar başarıyla hücresel güçleri analiz edebilirsiniz. Bu mechanos odaklanmak için bir kullanıcı sağlayanensitivity tahlil çıktı ziyade teknoloji kendisi ve daha geniş bir topluluk için kullanılabilir çekiş gücü ölçümleri yapar. Ayrıca, bu micropost diziler tam otomatik tarama doğru yolunu açmak için önemli bir adımdır.

MechProfiler analiz yazılımı dosya biçimi tiff, png, bmp ve jpg görüntüleri işler. Görüntüler floresan, faz kontrast ya da parlak alan ışık mikroskobu kullanılarak alınabilir. Başına bir program (mevcut: Şekil 12) ücretsiz Matlab Derleyici Runtime ile birlikte çalışır ve temel algoritmaları yaklaşık 1 dakika içinde tek veya birden fazla hücreleri ile görüntüleri işlemek için kullanıcı sağlayan aerodinamik görüntü işleme, izin verir. Ayrıca, bu hücreler ya yaşayan olabilir ya da "sabit".

MechProfiler yazılım ölçüde kaliteli ticari micropost diziler tekrarlanabilirlik dayanarak veri analizi verimini artırmak mümkün, daha spesifik olarak, varsayılan & #8220 non-deflected "dizisindeki her yazının konumunu ideal ızgara karşı kabul edilebilir (bu çalışmada kullanılan dizilerde ızgara imalat sapmalar az 100 nm idi).

Kısacası birinde, ilgilenilen bölgeye onları ekinler, analiz için görüntü dosyaları bir seçim açar hücreler tarafından kapsanan mesajları tanımlar veya atılması gereken sonrası pozisyonları belirler deplasmanlar / İdeal ızgara karşı güçlerini hesaplar ve nihayet Standart ofis-tabloya dahil, ihracat için bir olasılık tüm hücre özel verileri kaydeder.

Protocol

Micropost Dizileri 1. Kültürleme Hücreler Not: Tüm adımlar sterilite sağlamak için bir biyogüvenlik kabini içinde yapılmalıdır. Burada verilen miktarlar T25 hücre kültürü şişeleri içindir. Hücre kültürü ortamı tarifi ve hücre tohum yoğunluğu, kemik kanseri hücre çizgileri HuO9 ve M132 için optimize edilmiştir. Bir micropost dizisi üzerine tohumlama için hücre kültürü hazırlayın. Standart ışık mikroskobu kültür şişesi koyarak h…

Representative Results

Açıklanan tekniğin ana avantajı rutin laboratuvar çalışmaları içine hızlı ve etkin entegrasyonu için sadeliği ve potansiyeli yatıyor. Açık kaynak yazılım ile eşleştirilmiş yüksek kalitede ticari sensör dizileri kombinasyonu olur, aksi takdirde görüntü analizi ve yazılım geliştirme bilgisine temiz oda tesislerine ve derinlemesine erişimi gerektirir mekano-hassasiyeti hakkında bilgi vermektedir. 1 sunulan yöntemin iş akışını gösterir Şekil. Bu microp…

Discussion

Bu çalışma esas olarak giriş teknik ve pratik engellerin düşürerek çekiş kuvvet mikroskobu alanını ilerletmek istiyor. Bu engeller iki taraftan geliyor. Öncelikle çoğaltılabilir imalatları ve deneysel bir micropost dizisi komisyon için aşılması gereken çok sayıda önemsiz olmayan teknik zorluklar bulunmaktadır. Tipik bir deney yüzlerce veya hücrelerin hatta binlerce analizini gerektirebilir akılda tutarak – İkincisi, benzer olmayan önemsiz tek hücre güçlerinin güvenilir bir yarı otomatik…

Materials

T25 cell culture flasks	Nunc	156367
1x PBS-buffer	Sigma	D8537
0.5% Trypsin-EDTA	Life Technologies	15400054
Medium DMEM/F12	Sigma	D8437
FBS South America	Life Technologies	10270106
Penicillin-Streptomycin 100x	Sigma	P4333
15 ml centrifuge vials	Sarstedt	62.554.502
Micropost array	MicroDuits	MPA-col1/FN	Micropost dimensions:
pre-coated with Collagen I/Fibronectin			Ø= 6.4 µm, l=18.2 µm; grid= 13 µm, kcorr= 2.87 nN/µm
Ethanol abs p.A.	Merck	100.983
12-well plate	Nunc	150628
Formalin solution, neutral buffered 10%	Sigma	HT5011
Brilliant Blue G-250	Sigma	27815	Coomassie blue
Methanol ACS p.A.	Merck	1.06009
Acetic acid	Sigma	695092
Glass bottom dish	WillCo Wells BV	GWSb-3522	35 mm diameter, aperture 22 mm
T-100 Eclipse	Nikon	n/a	Inverted microscope
D3-L3	Nikon	n/a	Camera controler
DS Fi2	Nikon		Camera