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Neuroscience

Imagerie en trois dimensions et l’analyse des mitochondries dans les fibres nerveuses humaines intra-épidermiques

Published: September 29, 2017
doi:
10.3791/53369
, , ,
1University of Michigan Medical School, 2Department of Neurology,University of Michigan, 3Department of Internal Medicine,University of Michigan

Summary

Ce protocole utilise des techniques d’imagerie et d’analyse en trois dimensions (3D) de visualiser et de quantifier les mitochondries nerveuses spécifiques. Les techniques sont applicables à d’autres situations où un signal fluorescent est utilisé pour isoler un sous-ensemble des données d’un autre signal fluorescent.

Abstract

Le but du présent protocole est d’étudier les mitochondries dans les fibres nerveuses intra-épidermiques. Par conséquent, des techniques d’imagerie et d’analyse 3D ont été développés pour isoler les mitochondries nerveuses spécifiques et évaluer les altérations induites par la maladie des mitochondries dans l’extrémité distale des nerfs sensitifs. Le protocole associe immunohistochimie de fluorescence, microscopie confocale et techniques d’analyse des images 3D de visualiser et de quantifier les mitochondries nerveuses spécifiques. Paramètres détaillés sont définies dans les procédures afin de fournir un exemple concret d’utilisation de ces techniques pour isoler les mitochondries nerveuses spécifiques. Anticorps ont été utilisés pour étiqueter le nerf et signaux mitochondriales dans des sections de tissu de peau punch biopsies, qui a été suivie par immunofluorescence indirecte pour visualiser les nerfs et les mitochondries avec un signal fluorescent vert et rouge respectivement. Z-série images ont été acquises avec la microscopie confocale et logiciel d’analyse 3D a été utilisé pour traiter et analyser les signaux. Il n’est pas nécessaire de suivre les paramètres décrits dans, mais il est important d’être cohérent avec ceux choisis tout au long de la coloration, les étapes d’acquisition et d’analyse. La force de ce protocole est qu’il est applicable à une grande variété de circonstances où un signal fluorescent est utilisé pour isoler les autres signaux qui serait autrement impossibles à étudier seul.

Introduction

Mitochondries remplissent des fonctions cellulaires vitales qui comprennent la production d’énergie cellulaire, mise en mémoire tampon de calcium et réglementer nécrotiques et apoptose cellulaire mort1,2,3. Le système nerveux a un métabolisme élevé par rapport au corps4 suggérant que les neurones génèrent un degré élevé d’énergie cellulaire sous la forme d’adénosine triphosphate (ATP) par le biais de la respiration mitochondriale. Un grand nombre de documents de preuve que les fonctions neuronales dépendent de l’ATP5, surtout dans les synapses6. Par conséquent, la répartition des mitochondries dans les neurones est importante.

Au cours des 10 dernières années, que beaucoup d’information a montré que le trafic et l’accostage des mitochondries neuronales est très réglementées. Protéines motrices sont impliqués dans la distribution des mitochondries à compartiments cellulaires spécifiques tout au long du neurone. Traite des mitochondries est particulièrement importante parce que les neurones du projet les axones et les dendrites loin de soma. Les protéines motrices kinésine directement essentiellement antérograde (à l’opposé le soma) traite des mitochondries le long des microtubules pendant la dynéine protéines motrices direct motilité rétrograde (vers le soma)7,8,9 , 10. il sont a des signaux cellulaires un tel potentiel de membrane mitochondrial et la conduction d’impulsion qui influent sur la présence et la direction de mitochondrial trafic11,12,13.

En plus de transporter les mitochondries, il y a des protéines spécialisées à localiser les mitochondries pour les compartiments cellulaires spécifiques qui ont des exigences de haute énergie, tels que les nœuds de Ranvier et synapses8,14, 17. en effet, la majorité des mitochondries dans les axones sont non motiles9,13,18. Les protéines spécialisées comme mitochondries ancre syntaphilin aux microtubules le long des axones tandis que les autres protéines d’ancrage mitochondries à l’actine cytosquelette19–21. Facteurs de croissance et d’ions tels que le calcium ont été signalées à l’appui de la cessation du mouvement des mitochondries afin de les localiser dans des régions où ils sont nécessaires21,22,23.

Pris ensemble, le trafic et d’amarrage des mitochondries sont vitales pour le bon fonctionnement des neurones. À l’appui de cela, perturbation dans le trafic mitochondriale a été associée liée plusieurs maladies neurologiques dont la maladie d’Alzheimer, sclérose latérale amyotrophique, maladie de Charcot-Marie-Tooth, maladie de Huntington, spastique héréditaire paraparésie et atrophie optique15,24,25,26,27. Des études récentes ont mis l’accent sur le dysfonctionnement mitochondrial et la pathologie comme un mécanisme potentiel pour la neuropathie diabétique, la perte sensorielle associée diabète28,29,30,31 ,32,,33. L’hypothèse est que le diabète altère la distribution des mitochondries dans les projections sensorielles de terminaison nerveuse cutanée. Par conséquent, il a développé une technique pour visualiser et quantifier les mitochondries dans les fibres de nerf intra-épidermiques (IENFs), l’extrémité distale de la racine dorsale ganglion afférences sensorielles. La technique combine immunohistochimie de fluorescence spécifique mitochondriale et étiquettes de fibres nerveuses avec acquisition de série z microscopie confocale de signaux avec logiciel d’analyse d’image 3D puissant pour mesurer la distribution du nerf spécifiques mitochondries des biopsies punch cutanée humaine pour atteindre cet objectif.

Protocol

punch biopsies de la peau ont été extraites des sujets qui ont été recrutés dans un réseau de grands soins primaires communautaires au centre du diabète de l’Université de l’Utah (Salt Lake City, Utah). Cette étude a été approuvée par l’Université du Michigan Institutional Review Board et respecter les principes de la déclaration d’Helsinki. Écrit le consentement éclairé a été obtenu auprès de chaque personne concernée avant le test. 1. immunohistochimie fluorescen…

Representative Results

Visualisation et la quantification des mitochondries dans les IENFs humaines Fluorescence immunohistochimie permet l’étiquetage simultanée de signaux multiples dans les biopsies de la peau humaine pour visualiser les nerfs, les mitochondries et les noyaux. Une plaque à 96 puits constitue un moyen pratique d’organiser les étapes de la procédure de l’immunohistochimie. La figure 1</…

Discussion

Ce protocole est conçu pour isoler, de quantifier et d’analyser la taille et la distribution des mitochondries nerveuses spécifiques au sein de la IENFs en 3D de biopsies de la peau humaine. Il y a plusieurs étapes cruciales dans le protocole. L’immunohistochimie de fluorescence flottant est conçu pour souiller et analyser des signaux multiples dans chaque échantillon, fournissant une méthodologie plus souple pour la recherche exploratoire44,45. Cette p…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par les instituts nationaux de santé subventions K08 NS061039-01A2, le programme de recherche de neurologie & découverte et l’a. Alfred Taubman Medical Research Institute à l’Université du Michigan. Ce travail a utilisé la morphologie et l’Image analyse Core du Michigan Diabetes Research Center, financé par les instituts nationaux de santé subvention 5P 90 DK-20572 du National Institute of Diabetes et digestives et les maladies des reins. Les auteurs tiens à remercier J. Robinson Singleton et A. Gordon Smith (Université de l’Utah) pour leur généreux don d’échantillons de peau humaine.

Materials

2% Zamboni's Fixative Newcomer Supply, Middleton, WI  1459A 2% paraformaldehyde, 0.2% saturated picric acid in phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4
10X Phosphate Buffered Saline (PBS)  Fisher Scientific, Pittsburgh, PA BP399-4 To make up 1X PBS
Image-iT FX Signal Enhancer ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts I36933 enhances Alexa Fluor dye signals by reducing nonspecific binding
Anti-Protein Gene Product 9.5 Antibody (Rabbit Polyclonal) Proteintech Group Inc. Rosemont, IL 14730-1-AP abbreviated as PGP9.5, replaces discontinued AbD Serotec (Cat. No. 7863-0504) antibody
Anti-Pyruvate Dehydrogenase E2/E3bp Antibody (Mouse Monoclonal) abcam, Cambridge, MA ab110333 abbreviated as PDH
Goat anti-mouse Secondary antibody Alexa Fluor 594 conjugate ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts A-11034 red-fluorescent conjugated secondaryantibody
Goat anti-rabbit Secondary antibody Alexa Fluor 488 conjugate ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts A-11032 green-fluorescent conjugated secondaryantibody
Albumin, from Bovine Serum Sigma-Aldrich, St. Louis, MO A7906-100 abbreviated as BSA
Triton X- 100 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO T9284 abbreviated as TX-100
0.22 µm Filter EMD Millipore, Billerica
MA		 MILLEX GP SLGP 033NS 0.22 µm Millipore filter
Parafilm M Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 13-374-10 Curwood Wisconsin LLC Parafilm M (PM-996)
Non-calibrated Loop Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 22-032092 inoculating Loop by Decon LeLoop (MP 199-25)
96-well Assay Plate Corning Incorporated, Corning, NY 3603 96-well flat bottom plate
Prolong Gold antifade reagent with DAPI ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts P-36931 DAPI staining of nuclei
Microscope Cover Glass 50 x 24 mm Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 12-544E Coverslips
Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 12-550-15 Microscope Slides
Leica SP5 Laser Scanning Confocal Microscope Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL SP5 Confocal Microscope
Volocity x64 Software  Perkin Elmer, Waltham , MA version 4.4.0 Volocity software is used for Steps 3.1 and 3.2 in the protocol for image processing
Imaris x64 3 Dimensional Analysis Software Bitplane, Concord, MA version 7.7.1 Imaris software is used for Steps 3.3 through 3.5 in the protocol for image analysis
Excel Microsoft, Redmond, WA version Office 2013 Excel spreadsheet software is used for Step 3.6 in the protocol to summarize morphometric features
Optimum Cutting Temperature Compound Sakura Finetek USA, Inc., Torrance, CA 4583 abbreviated as OCT
Leica Cryostat Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL CM1850 Cryostat for cutting 50 µm sections
CellLight Mitochondria-GFP, BacMam 2.0 ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts C10600 Used as a postive control to label mitochondria with a green fluorescent signal
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Hamid, H. S., Hayes, J. M., Feldman, E. L., Lentz, S. I. Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers. J. Vis. Exp. (127), e53369, doi:10.3791/53369 (2017).
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