قياس الاستجابات الفسيولوجية لل<em> ذبابة الفاكهة</em> الخلايا العصبية الحسية إلى الدهن الفيرومونات عن طريق لايف التصوير الكالسيوم
Summary
The forelegs and proboscis of Drosophila contain a rich repertoire of gustatory sensory neurons. Here, we present a method using calcium imaging to measure physiological responses from sensory neurons in the foreleg and proboscis of live flies upon exogenous application of a gustatory pheromone.
Abstract
على عكس الثدييات والحشرات مثل ذبابة الفاكهة لديها عدة أجهزة طعم. الخلايا العصبية حسي كيميائي على الساقين، خرطوم، والأجنحة وحامل البيض من ذبابة الفاكهة تعبر عن مستقبلات الذوقية 1،2، القنوات الأيونية 3-6، ومستقبلات ionotropic 7 التي تشارك في الكشف عن العظة الحسية المتطايرة وغير المتطايرة. هذه الخلايا العصبية الاتصال مباشرة tastants مثل المواد الغذائية والمواد الضارة والفيرومونات، وبالتالي تؤثر على العديد من السلوكيات المعقدة مثل التغذية، وضع البيض والتزاوج. التسجيلات الكهربائي والتصوير الكالسيوم وقد استخدمت على نطاق واسع في الحشرات لقياس الاستجابات العصبية التي حركها هذه tastants. ومع ذلك، الكهربية يتطلب معدات متخصصة وقياسات الحصول على من sensillum وطعم واحد يمكن أن يكون تحديا تقنيا تبعا لنوع الخلايا، حجم، وموقف. وبالإضافة إلى ذلك، القرار الخلايا العصبية واحد في ذبابة الفاكهة يمكن أن يكون من الصعب تحقيقها منذ هوى طعم الشعيراتحد ذاته أكثر من نوع واحد من الخلايا العصبية حسي كيميائي. طريقة التصوير الكالسيوم الحية وصفها هنا يسمح استجابات الخلايا العصبية الذوقية واحدة في الذباب الحية لقياسها. هذا الأسلوب هو مناسبة خاصة لتصوير الاستجابات العصبية للالفيرومونات الدهون وأنواع يجند الأخرى التي لديها القابلية للذوبان في المذيبات انخفاض المياه القائمة.
Introduction
الحيوانات تعتمد على المعلومات الشمية والذوقية للتوسط القرارات الضرورية من أجل البقاء والتكاثر. فهم كيفية العظة حسي كيميائي يتم الكشف عنها ومعالجتها من قبل الجهاز العصبي يتطلب تحديد مستقبلات الحسية (ق) وبروابط كيميائية المقابلة. ذبابة الفاكهة كشف مجموعة متنوعة مذهلة من المركبات المتطايرة وغير المتطايرة والتي تشكل نموذجا ممتازا للدراسة الفسيولوجية الآليات الكامنة chemosensation. في حين أن أجهزة الشم تنظر الجزيئات غير المستقرة، وأجهزة الذوقية المتخصصة للكشف عن المركبات تقلبات منخفضة. هنا، فإننا نقدم وسيلة لقياس مباشرة الاستجابات العصبية من أجهزة طعم ذبابة الفاكهة إلى المنخفض التقلب، بروابط محبة للدهون.
وتشمل أجهزة الذوقية من ذبابة اليدين، خرطوم، والأجنحة. وزعت على السطح من أجهزة طعم لا يشبه الهياكل الشعر المعروفة باسم الشعيرات التي تستجيب إلى sugars، والبيرة، والأملاح والماء والفيرومونات 8. تم تصنيف الشعيرات شكليا إلى شعيرات طعم ومذاق أوتاد 9. وهناك حوالي 31 شعيرات الذوق على labellum التي يتم تصنيفها إلى طويلة (ل-نوع)، قصيرة (الصورة من نوع) والمتوسطة (ط من نوع) الأشكال التضاريسية. و'ل' و 'S' الشعيرات منزل 4 الخلايا العصبية الحسية التي تستجيب من الناحية الفسيولوجية للسكر (الخلية S)، قليل الملح (الخلية L1)، الملح العالية والمركبات المريرة (الخلية L2) والمياه (الخلية W) 10 11. و'ط' بيت 2 الخلايا العصبية الشعيرات الحسية، واحدة من الذي يستجيب على حد سواء لانخفاض الملح والسكر، في حين أن يستجيب أخرى إلى الملح ارتفاعه 12. هناك ما يقرب من 41 الشعيرات الذوق في الذكور و 26 من الإناث الشعيرات في توزيعها على كل من اليدين. لكل من الذكور والإناث، وهناك 21 الشعيرات على midleg، وحوالي 22 الشعيرات على hindleg 13. الخلايا العصبية الذوقية المحاطة الشعيرات الذوق على الساقين هي أيضا جlassified إلى أنواع L1، L2، W و S.
واحد طريقة معيارية لقياس النشاط الكهربائي من الخلايا العصبية واحدة يستخدم أقطاب الخلية أو الخلايا لتسجيل تدفق أيون. تسمح قياسات الكهربائي وظيفة الخلايا العصبية التي يتعين دراستها في الكائنات غير النموذجية مثل الأنواع ذبابة الفاكهة، العث، والنحل التي تفتقر إلى أدوات جينية شاملة لوضع العلامات العصبية. ومع ذلك، في حين أن الطرق الكهربية استخدمت بشكل روتيني لقياس النشاط من ذبابة الفاكهة طعم الشعيرات 4،13،14، وتطبيق هذا النهج يقدم العديد من التحديات التقنية. أولا، تذوق الشعر الخشن لا بد من تحديد القائمة على التشكل والموقع المكاني. على تعريف وقياس الكهربية يمكن يعوقه حجم صغير من الشعيرات، وسهولة الوصول محدودة بسبب الموقف، وصعوبة في تطبيق مجلدات تسيطر على التحفيز الكيميائي لتذوق الشعر الخشن. أيضا، وتحفيز الشعيرات قد تولد إشارات من أكثر من واحدنوع الخلايا العصبية 15. الثانية، والكشف عن إشارات كهربائية يمكن أن تتغير نتيجة للضجيج في الخلفية الناتجة عن الاهتزازات الميكانيكية والضوضاء من المعدات الإلكترونية. ثالثا، استخدام القطب شحذ يمكن أن تلحق الضرر إعداد الطاير، إذا ما استخدمت بشكل غير صحيح (14). وأخيرا، وتجميع وتلاعب الكهربية يتطلب المكونات الإلكترونية المتخصصة لتقديم الحوافز، وتسجيل إشارة، وتحليل البيانات ويمكن أن يكون مكلفا.
في د. البطن، وقد سهلت توافر أدوات ترميز وراثيا لتطوير تقنيات التصوير التي تسمح ردود المجموعات الصغيرة من الخلايا العصبية التي يتعين دراستها. أحد هذه التوجهات هو استخدام لمراسل CaLexA 16. في هذه الطريقة، وتنصهر تسلسل الجينات التي تشفر عامل النسخ LexA-VP16 والكالسيوم حساسة NFAT البروتين معا. تفعيل الكالسيوم من الكالسينيورين بروتين الفوسفاتيز يحفز-الفسفرة دي من NFAT، وبدوره، facilitaقسم التدريب والامتحانات وارداتها إلى النواة. داخل النواة، يربط المجال LexA لعزر ملزمة LexAop الحمض النووي التي توجه التعبير مراسل الأخضر بروتين فلوري (GFP)، مما يتيح تحديد المستدام من الخلايا العصبية تنشيط وظيفيا. وقد استخدم النهج بنجاح لقياس استجابة من الكبيبات حاسة الشم محددة في الفص antennal بعد التعرض للذباب حية إلى الرائحة 16. مؤخرا، تم قياس الاستجابات الفسيولوجية للIR52c الخلايا العصبية المستقبلة الذوقية من الذباب الحية باستخدام CaLexA 7. ومع ذلك، من أجل هذه الدراسة، كان من الضروري أن الذباب العمر لمدة تصل إلى 6 أسابيع لتعزيز GFP النسخ. في حين المناعية مع الأجسام المضادة لمكافحة GFP يمكن استخدامها لتعزيز إشارة CaLexA، فإن هذا الأسلوب يتطلب تثبيت الأنسجة، مما يحول دون إمكانية التصوير الخلية الحية.
كما استخدمت الكالسيوم البروتين مؤشر GCaMP المشفرة وراثيا على نطاق واسع لدراسة استجابات الخلايا العصبية في عدد منالأنواع 17. وGCaMP البروتين تتفلور مع كثافة منخفضة قبل لتحفيز الخلايا العصبية. تطبيق التحفيز يؤدي إمكانات العمل في الخلايا العصبية، مما أدى إلى تدفق الكالسيوم 2+. GCaMP، منضما إلى الكالسيوم 2+، يخضع لتغيير متعلق بتكوين، الامر الذي ادى الى يتألق مع كثافة أكثر إشراقا (الشكل 1). تم استخدام نهج التصوير الكالسيوم الخلايا العصبية واحدة وضعت مؤخرا لتحديد الجلوكوز كما يجند لالرجل الاماميه محددة الخلايا العصبية الذوقية Gr61a 18. في هذه الدراسة، تمت تغطية اليدين تشريح من ذبابة الفاكهة المعدلة وراثيا معربا عن GCaMP في الخلايا العصبية الذوقية Gr61a مع طبقة من الاغاروز قبل التصوير. ومع ذلك، فإن استخدام تشريح الأنسجة يمكن أن يسبب المتهدمة في نهاية المطاف التعبير GCaMP، مما يحد من قياس الوقت وحساسية الكشف. وبالإضافة إلى ذلك، الاغاروز يمكن أن تحد من حساسية بسبب مستويات خلفية عالية من مضان وخصائص تشتت الضوء فيها.
تس معالجة بعض من هذه العيوب، وصفنا استخدام التصوير الكالسيوم بوساطة GCaMP لتسجيل الاستجابات الفسيولوجية من الرجل الاماميه وخرطوم الخلايا العصبية الذوقية للحيوانات سليمة. نقدم لك مجموعة من الاستجابات الفسيولوجية للGr68a والخلايا العصبية ppk23 معربا عن المشفرة وراثيا GCaMP5G 19 إلى الدهن فرمون ذبابة الفاكهة، (3 R، 11 Z 19 Z) -3-acetoxy-11،19-octacosadien-1-را (CH503) 20، 21. يتم قياس الاستجابات العصبية عن طريق قياس الزيادة في مضان من إشارة GCaMP5G خلال التحفيز فرمون. في هذا البروتوكول، ويتم تصوير الخلايا العصبية لمدة إجمالية قدرها 120 ثانية، وهو ما يكفي لتمييز أنماط تفعيل الخلايا العصبية في الخلايا الفردية.
Protocol
Representative Results
Discussion
نحن هنا وصف طريقة لأداء التصوير الكالسيوم الحية من الخلايا العصبية الطرفية ذبابة الفاكهة في 2 مختلفة الحواس. كا 2+ -evoked الردود الفلورسنت GCaMP في Gr68a الخلايا العصبية الناجمة عن يجند فرمون كانت CH503 الجرعة التي تعتمد على والكمية. كان من الممكن أيضا أن نتبين مختلف …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Singapore National Research Foundation (grant NRF-RF2010-06 to J.Y.Y.).
Materials
| Gr68a-Gal4 | Gift from H. Amrein (Texas A&M Health Science Center, TX, USA) and J. Carlson (Yale University, CT, USA) | ||
| ppk23-Gal4 | Gift from K. Scott (Univ. of California, Berkeley, CA, USA) | ||
| UAS-GCaMP5 | 42037 | Bloomington Drosophila Stock Center | |
| 0.17 mm coverslip (Gold-Seal coverslip) | Electron Microscopy Services | 63790-10 | |
| Nail polish, "Hard as Nails Clear" | Sally Hansen | ||
| PAP pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
| Paint brush | fine-tipped brush | ||
| Tape | Scotch brand | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 13021 | |
| Ethanol, lab grade | Merck | 10094 | |
| Hexane, HPLC grade | Sigma-Aldrich | H303SK-4 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| PBST | Recipe described in the protocol section | ||
| CH503 | Synthesis described in Mori et al., 2010 | ||
| sCMOS Camera (ORCA Flash4.0) | Hamamatsu | C11578-22U | |
| Microscope (Ti-Eclipse) | Nikon | Ni-E | |
| Spinning Disk Scan head | Yokogawa | CSU-X1-A1 | |
| Aquistion Software (MetaMorph Premier) | Molecular Devices | 40002 | |
| Fiji software | open source | http://fiji.sc/Fiji |
References
- Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R. Candidate taste receptors in Drosophila. Science. 287, 1830-1834 (2000).
- Dunipace, L., Meister, S., McNealy, C., Amrein, H. Spatially restricted expression of candidate taste receptors in the Drosophila gustatory system. Curr. Biol. 11, 822-835 (2001).
- Thistle, R., Cameron, P., Ghorayshi, A., Dennison, L., Scott, K. Contact chemoreceptors mediate male-male repulsion and male-female attraction during Drosophila courtship. Cell. 149, 1140-1151 (2012).
- Toda, H., Zhao, X., Dickson, B. J. The Drosophila female aphrodisiac pheromone activates ppk23(+) sensory neurons to elicit male courtship behavior. Cell Rep. 1, 599-607 (2012).
- Vijayan, V., Thistle, R., Liu, T., Starostina, E., Pikielny, C. W. Drosophila pheromone-sensing neurons expressing the ppk25 ion channel subunit stimulate male courtship and female receptivity. PLoS Genet. 10, 1004238 (2014).
- Lu, B., LaMora, A., Sun, Y., Welsh, M. J., Ben-Shahar, Y. ppk23-Dependent chemosensory functions contribute to courtship behavior in Drosophila melanogaster. PLoS Genet. 8, e1002587 (2012).
- Koh, T. W., et al. The Drosophila IR20a Clade of Ionotropic Receptors Are Candidate Taste and Pheromone Receptors. Neuron. 83, 850-865 (2014).
- Montell, C. A taste of the Drosophila gustatory receptors. Curr. Opin. Neurobiol. 19, 345-353 (2009).
- Shanbhag, S. R., Park, S. K., Pikielny, C. W., Steinbrecht, R. A. Gustatory organs of Drosophila melanogaster: fine structure and expression of the putative odorant-binding protein PBPRP2. Cell Tissue Res. 304, 423-437 (2001).
- Meunier, N., Marion-Poll, F., Rospars, J. P., Tanimura, T. Peripheral coding of bitter taste in Drosophila. J. Neurobiol. 56, 139-152 (2003).
- Rodrigues, V., Siddiqi, O. A gustatory mutant of Drosophila defective in pyranose receptors. Mol. Genet. Genomics. 181, 406-408 (1981).
- Hiroi, M., Meunier, N., Marion-Poll, F., Tanimura, T. Two antagonistic gustatory receptor neurons responding to sweet-salty and bitter taste in Drosophila. J. Neurobiol. 61, 333-342 (2004).
- Ling, F., Dahanukar, A., Weiss, L. A., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of taste coding in the legs of Drosophila. J. Neurosci. 34, 7148-7164 (2014).
- Delventhal, R., Kiely, A., Carlson, J. R. Electrophysiological recording from Drosophila labellar taste sensilla. J. Vis. Exp. , e51355 (2014).
- Meunier, N., Marion-Poll, F., Lansky, P., Rospars, J. P. Estimation of the individual firing frequencies of two neurons recorded with a single electrode. Chem. Senses. 28, 671-679 (2003).
- Masuyama, K., Zhang, Y., Rao, Y., Wang, J. W. Mapping neural circuits with activity-dependent nuclear import of a transcription factor. J. Neurogenet. 26, 89-102 (2012).
- Akerboom, J., et al. Crystal structures of the GCaMP calcium sensor reveal the mechanism of fluorescence signal change and aid rational design. J. Biol. Chem. 284, 6455-6464 (2009).
- Miyamoto, T., Chen, Y., Slone, J., Amrein, H. Identification of a Drosophila glucose receptor using Ca2+ imaging of single chemosensory neurons. PloS One. 8, e56304 (2013).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J. Neurosci. 32, 13819-13840 (2012).
- Shikichi, Y., et al. Pheromone synthesis. Part 250: Determination of the stereostructure of CH503 a sex pheromone of male Drosophila melanogaster, as (3R,11Z,19Z)-3-acetoxy-11,19-octacosadien-1-ol by synthesis and chromatographic analysis of its eight isomers. Tetrahedron. 68, 3750-3760 (2012).
- Yew, J. Y., et al. A new male sex pheromone and novel cuticular cues for chemical communication in Drosophila. Curr. Biol. 19, 1245-1254 (2009).
- Bray, S., Amrein, H. A putative Drosophila pheromone receptor expressed in male-specific taste neurons is required for efficient courtship. Neuron. 39, 1019-1029 (2003).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
- Kaissling, K. E., Zack Strausfeld, C., Rumbo, E. R. Adaptation processes in insect olfactory receptors. Mechanisms and behavioral significance. Ann. N. Y. Acad. Sci. 510, 104-112 (1987).
- Marder, E., Bucher, D. Central pattern generators and the control of rhythmic movements. Curr. Biol. 11, 986-996 (2001).
- Koepsell, K., Wang, X., Hirsch, J. A., Sommer, F. T. Exploring the function of neural oscillations in early sensory systems. Front Neurosci. 4, 53 (2010).
- Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature. 361, 315-325 (1993).
- Busch, K. E., et al. Tonic signaling from O(2) sensors sets neural circuit activity and behavioral state. Nat Neurosci. 15, 581-591 (2012).
