Измерение физиологических реакций<em> Drosophila</em> Сенсорными нейронами липид феромонов с использованием живых визуализации кальция
Summary
The forelegs and proboscis of Drosophila contain a rich repertoire of gustatory sensory neurons. Here, we present a method using calcium imaging to measure physiological responses from sensory neurons in the foreleg and proboscis of live flies upon exogenous application of a gustatory pheromone.
Abstract
В отличие от млекопитающих, насекомых , таких как Drosophila есть несколько органов вкуса. В хемосенсорные нейроны на ногах, хоботок, крылья и яйцеклада дрозофилы выражают вкусовых рецепторов 1,2, ионные каналы 3-6 и ионотропные рецепторы 7, которые участвуют в обнаружении летучих и нелетучих сенсорных сигналов. Эти нейроны напрямую связаться с Tastants, такие как продукты питания, вредных веществ и феромонов и, следовательно, влияют на многие сложные поведения, такие как кормление, яйцекладки и вязки. Электрод записи и визуализации кальция широко используются в насекомых для количественного определения нейронные реакции, навеянные этими Tastants. Тем не менее, электрофизиологии требует специального оборудования и получения измерений от одного вкуса сенсиллы может быть технически сложным в зависимости от клеточного типа, размера и положения. Кроме того, одной резолюции нейрон у дрозофилы может быть трудно достичь , так как вкус сенсилл хоуС.Е. более чем один тип хемосенсорной нейроне. Метод живой визуализации кальция, описанный здесь позволяет реакции отдельных нейронов вкусовыми в живых мух необходимо измерить. Этот способ особенно подходит для получения изображения нейрональных ответов на липидные феромонов и других лигандов типов, которые имеют низкую растворимость в воде на основе растворителей.
Introduction
Животные полагаются на обонятельный и вкусовой информации посредничать решения, необходимые для выживания и размножения. Понимание того, как хемосенсорных сигналы обнаруживаются и обрабатываются нервной системы требует идентификации сенсорных рецепторов (ов) и соответствующих химических лигандов. Drosophila обнаружить ошеломляющее разнообразие летучих и нелетучих соединений и являются прекрасной моделью , в которой изучить физиологические механизмы, лежащие в основе chemosensation. В то время как обонятельные органы воспринимают летучие молекулы, вкусовой органы специализированы для выявления низкой летучести соединений. Здесь мы представляем метод непосредственного измерения нейронные ответы от вкусовых органов дрозофилы к низкой волатильности, липофильных лигандов.
Вкусовые органы мухи включают передних, хоботок и крылья. Распределенные на поверхности органов, вкусовыми известны как сенсиллах похожие на волосы структуры, которые отвечают на Sugars, настоек, соли, воды и феромоны 8. Сенсиллы были классифицированы морфологически на вкус щетиной и вкус колышки 9. Есть около 31 вкус щетина на labellum, которые классифицируются в длинную (L-типа), короткие (s-типа) и промежуточные (I-типа) морфологией. Сенсиллы дом 4 сенсорные нейроны 'L' и 'S' , что физиологически реагируют на сахар (Клетка S), с низким содержанием соли (клетка L1), с высоким содержанием соли и горькие соединения (ячейка L2) и воды (W клеток) 10 , 11. "Я" сенсиллах дом 2 сенсорных нейронов, один из которых реагирует как с низким содержанием соли и сахара, в то время как другие реагирует на высокой концентрации соли 12. Есть приблизительно 41 вкус сенсиллы у самцов и 26 самок сенсиллы в распределенных на каждом из передних ног. Для мужчин и женщин, есть 21 сенсиллы на midleg, и около 22 сенсиллы на задних ног 13. Нейроны вкусовым приложенные вкуса сенсиллах на ногах также свана в L1, L2, W и S типов.
Один стандартный метод измерения электрической активности от отдельных нейронов использует внеклеточные или внутриклеточные электроды для записи потока ионов. Измерения электродов позволяют нейронная функции должны быть изучены в не модельных организмов , таких как виды Drosophila, мотыльков и пчел , которые не имеют обширные генетические инструменты для нервной маркировки. Тем не менее, в то время как электрофизиологические методы были обычно используются для измерения активности от Drosophila вкуса сенсиллы 4,13,14, применяя этот подход несколько технических проблем. Во-первых, вкус щетина должны быть идентифицированы на основе морфологии и пространственного расположения. После идентификации, электрофизиологических измерений может быть затруднено из-за малого размера сенсиллах, ограниченный доступ из-за позиции, а также трудности в применении контролируемых объемов химического стимула к вкусу щетиной. Кроме того, стимуляция сенсиллах может генерировать сигналы от более чем однойнейронная тип 15. Во-вторых, обнаружение электрических сигналов могут быть искажены фонового шума в результате механических вибраций и шума от электронного оборудования. В- третьих, использование заостренного электрода может привести к повреждению препарат муху, при неправильном использовании 14. И, наконец, сборке электрофизиологии буровой установки требует специализированных электронных компонентов для доставки стимула, записи сигнала и анализа данных и может быть дорогостоящим.
В D. MELANOGASTER, наличие генетически кодируемых инструментов способствовало развитию методов визуализации , которые позволяют ответы небольших популяций нейронов для изучения. Одним из таких подходов является использование репортера CaLexA 16. В этом методе, генные последовательности, кодирующие фактор транскрипции LexA-VP16 и кальций чувствительный белок NFAT сплавлены вместе. активация кальциевая белка фосфатазы кальциневрина катализирует де-фосфорилирование NFAT и, в свою очередь, facilitaTES его импорт в ядро. Внутри ядра, домен LexA связывается с мотив связывания LexAop-ДНК, которая направляет экспрессию зеленого флуоресцентного белка (GFP) репортера, что позволяет устойчивую идентификацию функционально активированных нейронов. Этот подход был успешно использован для измерения реакции специфического обонятельного клубочков в усиков доли после воздействия живых мух на одоранта 16. В последнее время физиологические реакции IR52c нейронов вкусовыми рецепторами измеряли от живых мух с использованием CaLexA 7. Тем не менее, для этого исследования, это было необходимо для мух возраста до 6 недель для повышения GFP транскрипции. В то время как иммунным окрашиванием с анти-GFP антитела могут быть использованы для усиления сигнала CaLexA, этот метод требует фиксации тканей, тем самым, исключающие возможность для живых клеток.
Генетически закодированы кальция индикатор белка GCaMP также широко используется для изучения нейрональных ответов в ряде17 видов. Белок GCaMP флуоресцирует с низкой интенсивностью до стимуляции нейронов. Применение стимула вызывает потенциал действия в нейроне, что приводит к притоку Ca 2+. GCaMP, связанный с Са 2+, претерпевает конформационные изменения, заставляя его флуоресцировать с яркой интенсивностью (рисунок 1). Недавно разработанный одним нейроном подход визуализации кальция был использован для идентификации глюкозы в качестве лиганда для передней конечности специфических нейронов вкусовыми Gr61a 18. В этом исследовании, расчлененные передние конечности от трансгенного дрозофилы , выражающие GCaMP в вкусовыми нейронов Gr61a были покрыты слоем агарозы до начала визуализации. Тем не менее, использование рассеченной ткани может привести к возможной изношенном выражения GCaMP, ограничивая тем самым время измерения и чувствительность обнаружения. Кроме того, агарозы может ограничить чувствительность из-за высоких фоновых уровней флуоресценции и его свойства рассеяния света.
TO решить некоторые из этих недостатков, мы опишем использование GCaMP-опосредованной визуализации кальция для записи физиологических реакций от лапе и хобота вкусовыми нейронов интактных животных. Нам показывают физиологические реакции Gr68a и ppk23 нейроны , выражающие генетически закодированы GCaMP5G 19 с липидной феромон дрозофилы (R 3, 11 Z, 19 Z) -3-ацетокси-11,19-octacosadien-1-ол (CH503) 20, 21. Нейронные ответа измеряется путем количественного увеличения флуоресценции сигнала GCaMP5G во время стимуляции феромонов. В этом протоколе нейроны изображаются на общей продолжительностью 120 сек, что вполне достаточно, чтобы дифференцировать паттерны нейрональной активации в отдельных клетках.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы опишем здесь метод для выполнения живого изображения кальция дрозофилы периферических нейронов в 2 -х различных органов чувств. Ca 2+ -evoked ответов флуоресцентных GCaMP в Gr68a-нейронов , вызванных феромона лиганда CH503 были дозозависимое и количественный. Также можно было различи?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Singapore National Research Foundation (grant NRF-RF2010-06 to J.Y.Y.).
Materials
| Gr68a-Gal4 | Gift from H. Amrein (Texas A&M Health Science Center, TX, USA) and J. Carlson (Yale University, CT, USA) | ||
| ppk23-Gal4 | Gift from K. Scott (Univ. of California, Berkeley, CA, USA) | ||
| UAS-GCaMP5 | 42037 | Bloomington Drosophila Stock Center | |
| 0.17 mm coverslip (Gold-Seal coverslip) | Electron Microscopy Services | 63790-10 | |
| Nail polish, "Hard as Nails Clear" | Sally Hansen | ||
| PAP pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
| Paint brush | fine-tipped brush | ||
| Tape | Scotch brand | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 13021 | |
| Ethanol, lab grade | Merck | 10094 | |
| Hexane, HPLC grade | Sigma-Aldrich | H303SK-4 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| PBST | Recipe described in the protocol section | ||
| CH503 | Synthesis described in Mori et al., 2010 | ||
| sCMOS Camera (ORCA Flash4.0) | Hamamatsu | C11578-22U | |
| Microscope (Ti-Eclipse) | Nikon | Ni-E | |
| Spinning Disk Scan head | Yokogawa | CSU-X1-A1 | |
| Aquistion Software (MetaMorph Premier) | Molecular Devices | 40002 | |
| Fiji software | open source | http://fiji.sc/Fiji |
References
- Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R. Candidate taste receptors in Drosophila. Science. 287, 1830-1834 (2000).
- Dunipace, L., Meister, S., McNealy, C., Amrein, H. Spatially restricted expression of candidate taste receptors in the Drosophila gustatory system. Curr. Biol. 11, 822-835 (2001).
- Thistle, R., Cameron, P., Ghorayshi, A., Dennison, L., Scott, K. Contact chemoreceptors mediate male-male repulsion and male-female attraction during Drosophila courtship. Cell. 149, 1140-1151 (2012).
- Toda, H., Zhao, X., Dickson, B. J. The Drosophila female aphrodisiac pheromone activates ppk23(+) sensory neurons to elicit male courtship behavior. Cell Rep. 1, 599-607 (2012).
- Vijayan, V., Thistle, R., Liu, T., Starostina, E., Pikielny, C. W. Drosophila pheromone-sensing neurons expressing the ppk25 ion channel subunit stimulate male courtship and female receptivity. PLoS Genet. 10, 1004238 (2014).
- Lu, B., LaMora, A., Sun, Y., Welsh, M. J., Ben-Shahar, Y. ppk23-Dependent chemosensory functions contribute to courtship behavior in Drosophila melanogaster. PLoS Genet. 8, e1002587 (2012).
- Koh, T. W., et al. The Drosophila IR20a Clade of Ionotropic Receptors Are Candidate Taste and Pheromone Receptors. Neuron. 83, 850-865 (2014).
- Montell, C. A taste of the Drosophila gustatory receptors. Curr. Opin. Neurobiol. 19, 345-353 (2009).
- Shanbhag, S. R., Park, S. K., Pikielny, C. W., Steinbrecht, R. A. Gustatory organs of Drosophila melanogaster: fine structure and expression of the putative odorant-binding protein PBPRP2. Cell Tissue Res. 304, 423-437 (2001).
- Meunier, N., Marion-Poll, F., Rospars, J. P., Tanimura, T. Peripheral coding of bitter taste in Drosophila. J. Neurobiol. 56, 139-152 (2003).
- Rodrigues, V., Siddiqi, O. A gustatory mutant of Drosophila defective in pyranose receptors. Mol. Genet. Genomics. 181, 406-408 (1981).
- Hiroi, M., Meunier, N., Marion-Poll, F., Tanimura, T. Two antagonistic gustatory receptor neurons responding to sweet-salty and bitter taste in Drosophila. J. Neurobiol. 61, 333-342 (2004).
- Ling, F., Dahanukar, A., Weiss, L. A., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of taste coding in the legs of Drosophila. J. Neurosci. 34, 7148-7164 (2014).
- Delventhal, R., Kiely, A., Carlson, J. R. Electrophysiological recording from Drosophila labellar taste sensilla. J. Vis. Exp. , e51355 (2014).
- Meunier, N., Marion-Poll, F., Lansky, P., Rospars, J. P. Estimation of the individual firing frequencies of two neurons recorded with a single electrode. Chem. Senses. 28, 671-679 (2003).
- Masuyama, K., Zhang, Y., Rao, Y., Wang, J. W. Mapping neural circuits with activity-dependent nuclear import of a transcription factor. J. Neurogenet. 26, 89-102 (2012).
- Akerboom, J., et al. Crystal structures of the GCaMP calcium sensor reveal the mechanism of fluorescence signal change and aid rational design. J. Biol. Chem. 284, 6455-6464 (2009).
- Miyamoto, T., Chen, Y., Slone, J., Amrein, H. Identification of a Drosophila glucose receptor using Ca2+ imaging of single chemosensory neurons. PloS One. 8, e56304 (2013).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J. Neurosci. 32, 13819-13840 (2012).
- Shikichi, Y., et al. Pheromone synthesis. Part 250: Determination of the stereostructure of CH503 a sex pheromone of male Drosophila melanogaster, as (3R,11Z,19Z)-3-acetoxy-11,19-octacosadien-1-ol by synthesis and chromatographic analysis of its eight isomers. Tetrahedron. 68, 3750-3760 (2012).
- Yew, J. Y., et al. A new male sex pheromone and novel cuticular cues for chemical communication in Drosophila. Curr. Biol. 19, 1245-1254 (2009).
- Bray, S., Amrein, H. A putative Drosophila pheromone receptor expressed in male-specific taste neurons is required for efficient courtship. Neuron. 39, 1019-1029 (2003).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
- Kaissling, K. E., Zack Strausfeld, C., Rumbo, E. R. Adaptation processes in insect olfactory receptors. Mechanisms and behavioral significance. Ann. N. Y. Acad. Sci. 510, 104-112 (1987).
- Marder, E., Bucher, D. Central pattern generators and the control of rhythmic movements. Curr. Biol. 11, 986-996 (2001).
- Koepsell, K., Wang, X., Hirsch, J. A., Sommer, F. T. Exploring the function of neural oscillations in early sensory systems. Front Neurosci. 4, 53 (2010).
- Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature. 361, 315-325 (1993).
- Busch, K. E., et al. Tonic signaling from O(2) sensors sets neural circuit activity and behavioral state. Nat Neurosci. 15, 581-591 (2012).
