测量的生理反应<em>果蝇</em>感觉神经元脂质费洛蒙使用实时钙成像
Summary
The forelegs and proboscis of Drosophila contain a rich repertoire of gustatory sensory neurons. Here, we present a method using calcium imaging to measure physiological responses from sensory neurons in the foreleg and proboscis of live flies upon exogenous application of a gustatory pheromone.
Abstract
不同于哺乳动物，昆虫例如果蝇有多个味觉器官。在腿部，长鼻，翅膀和果蝇的产卵的化学感受神经元表达味觉受体1,2，离子通道3-6，和所涉及的检测易失性和非易失性的感官提示的离子型受体7。这些神经元直接联系促味剂，如食品，有毒物质和信息素，因而影响许多复杂的行为如摄食，产卵和配合。电极录音和钙成像已被广泛用于在昆虫量化这些促味剂诱发的神经元的反应。然而，电需要从单一口味感器专用设备和获取测量值可以根据细胞类型，大小和位置在技术上具有挑战性。此外，在果蝇单个神经元分辨率是很困难的，因为味觉感受器后实现本身多于一种类型的化学感受神经元。此处描述的活钙成像法允许测量在活蝇单味觉神经元的响应。这种方法特别适用于成像脂质信息素和其他配体类型的具有在水基溶剂的溶解度低神经元的反应。
Introduction
动物依靠嗅觉和味觉的信息，以调解的生存和繁衍至关重要的决定。理解暗示如何化学感受检测和由神经系统处理要求感官受体（S）和相应的化学配位体的识别。 果蝇检测了惊人的各种挥发性和非挥发性化合物，并且在其中，研究生理极好模型机制的基本chemosensation。而嗅觉器官感知挥发性分子，味觉器官是专门用于检测低挥发性化合物。在这里，我们提出了直接测量果蝇的味觉器官低挥发性，亲脂性配体神经元的反应的方法。
苍蝇的味觉器官包括前腿，喙，和翅膀。分发的味觉器官的表面上是称为感器毛发状结构，其为s响应ugars，苦味，盐，水和费洛蒙8。该感受器已形态分为刷毛的味道和口感钉9。有关于被分类为长（l型）唇瓣约31味刷毛，短（S型）和中间体（i型）的形态。在'L'和'S'是生理糖回应感器房子4感觉神经元（在S细胞），低盐（L1细胞），高盐和苦味化合物（二级电池）和水（在W单元）10 ，11。的“i”感器房屋2的感觉神经元，其中的一个响应既低盐和糖，而其他响应高盐12。有男性约41的味道感受器和分布在每个前肢女26感器。对于男性和女性中，有21感器上midleg，并在后腿13约22感器。由味道感器上腿包围的味觉神经元还包含classified成L1，L2 W和S的类型。
从单个神经元测量电活动的一种标准方法使用外或细胞内的电极来记录离子流。电极测量允许非模式生物进行研究，例如果蝇 ，蛾，和缺乏神经标记广泛的遗传工具蜜蜂神经功能。然而，尽管电生理方法已被经常使用从果蝇味觉测量活动感器4,13,14，运用这种方法存在一些技术挑战。首先，味道刷毛需要基于形态学和空间位置被识别。经鉴定，电测量可通过感受器的尺寸小的阻碍，限制无障碍由于位置，以及难以应用化学刺激的控制卷味道塞得满满的。另外，感器的刺激可以产生一个以上的信号神经型15。其次，电信号检测可以通过从电子设备的机械振动和噪声产生的背景噪音混淆。三，使用锋利的电极会损坏飞行准备，如果使用不当，14。最后，组装电钻机需要刺激递送，信号记录，和数据分析的专门的电子元件，并且可以是昂贵的。
在D.果蝇的基因编码工具的可用性提供了便利的成像技术，使神经元的小种群的反应进行研究开发。一种这样的方法是使用CaLexA记者16。在此方法中，编码的LexA-VP16转录因子和钙敏感蛋白NFAT基因序列融合在一起。的蛋白磷酸酶钙调磷酸酶的钙活化催化NFAT的去磷酸化，并反过来，facilitaTES其导入到细胞核。在细胞核内时，LexA的结构域结合到其引导绿色荧光蛋白（GFP）报道分子的表达，从而使功能性激活的神经元的持续识别LexAop DNA结合基序。该方法已成功地用于测量以下的活苍蝇暴露于臭剂16具体嗅小球中的触角叶的响应。近日，IR52c味觉受体神经元的生理反应，从使用CaLexA 7活苍蝇测量。然而，对于本研究，这是必要的，以年龄苍蝇为长达6周，以提高GFP转录。同时用抗GFP抗体免疫染色可以用于促进CaLexA信号，这种方法将需要组织固定，从而排除了活细胞成像的可能性。
遗传编码的钙指示剂蛋白GCaMP也被广泛用于研究在一些神经元的反应种17。蛋白质GCaMP前神经元的刺激荧光强度低。刺激的应用程序触发的神经元的动作电位，从而导致钙离子的流入。 GCaMP，势必钙 ，经历构象变化，导致它与亮强度（ 图1）发出荧光。最近开发的单神经元钙成像方法被用于鉴定葡萄糖作为配位体的前腿特定Gr61a味觉神经元18。在这项研究中，从转基因果蝇中Gr61a味觉神经元表达GCaMP解剖前肢上覆盖成像之前琼脂糖层。然而，使用解剖组织可引起GCaMP表达的最终破旧，从而限制了测量时间和检测灵敏度。此外，琼脂糖可以限制灵敏度由于荧光的高背景水平及其光散射特性。
ŧO地址一些弊端，我们描述了使用GCaMP介导的钙成像的记录从前肢和长鼻完整的动物的味觉神经细胞的生理反应。我们表明Gr68a的表达遗传编码GCaMP5G 19至果蝇脂质信息素的生理反应和ppk23神经元，（3 的R，11 Z，19 Z）-3-乙酰氧基11,19-octacosadien -1-醇（CH503）20， 21。神经元的反应是通过量化信息素的刺激过程中GCaMP5G信号的荧光增加测量。在这个协议中，神经元被成像为120秒，这足以区分在各个细胞神经元激活模式中的一个总的持续时间。
Protocol
Representative Results
Discussion
我们在这里描述在2个不同的感觉器官进行果蝇外周神经元的活钙成像的方法。该钙 -evoked由信息素配体CH503呈剂量依赖性和定量诱导Gr68a神经元GCaMP荧光反应。它也可以辨别不同的神经反应模式，如阶段性和补品响应。
显示相位响应神经元被认为可以快速适应不断刺激。这种类型的响应的已用气味探测25和节奏运动活动图形26的生成有关。相比之?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Singapore National Research Foundation (grant NRF-RF2010-06 to J.Y.Y.).
Materials
| Gr68a-Gal4 | Gift from H. Amrein (Texas A&M Health Science Center, TX, USA) and J. Carlson (Yale University, CT, USA) | ||
| ppk23-Gal4 | Gift from K. Scott (Univ. of California, Berkeley, CA, USA) | ||
| UAS-GCaMP5 | 42037 | Bloomington Drosophila Stock Center | |
| 0.17 mm coverslip (Gold-Seal coverslip) | Electron Microscopy Services | 63790-10 | |
| Nail polish, "Hard as Nails Clear" | Sally Hansen | ||
| PAP pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
| Paint brush | fine-tipped brush | ||
| Tape | Scotch brand | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 13021 | |
| Ethanol, lab grade | Merck | 10094 | |
| Hexane, HPLC grade | Sigma-Aldrich | H303SK-4 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| PBST | Recipe described in the protocol section | ||
| CH503 | Synthesis described in Mori et al., 2010 | ||
| sCMOS Camera (ORCA Flash4.0) | Hamamatsu | C11578-22U | |
| Microscope (Ti-Eclipse) | Nikon | Ni-E | |
| Spinning Disk Scan head | Yokogawa | CSU-X1-A1 | |
| Aquistion Software (MetaMorph Premier) | Molecular Devices | 40002 | |
| Fiji software | open source | http://fiji.sc/Fiji |
References
- Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R. Candidate taste receptors in Drosophila. Science. 287, 1830-1834 (2000).
- Dunipace, L., Meister, S., McNealy, C., Amrein, H. Spatially restricted expression of candidate taste receptors in the Drosophila gustatory system. Curr. Biol. 11, 822-835 (2001).
- Thistle, R., Cameron, P., Ghorayshi, A., Dennison, L., Scott, K. Contact chemoreceptors mediate male-male repulsion and male-female attraction during Drosophila courtship. Cell. 149, 1140-1151 (2012).
- Toda, H., Zhao, X., Dickson, B. J. The Drosophila female aphrodisiac pheromone activates ppk23(+) sensory neurons to elicit male courtship behavior. Cell Rep. 1, 599-607 (2012).
- Vijayan, V., Thistle, R., Liu, T., Starostina, E., Pikielny, C. W. Drosophila pheromone-sensing neurons expressing the ppk25 ion channel subunit stimulate male courtship and female receptivity. PLoS Genet. 10, 1004238 (2014).
- Lu, B., LaMora, A., Sun, Y., Welsh, M. J., Ben-Shahar, Y. ppk23-Dependent chemosensory functions contribute to courtship behavior in Drosophila melanogaster. PLoS Genet. 8, e1002587 (2012).
- Koh, T. W., et al. The Drosophila IR20a Clade of Ionotropic Receptors Are Candidate Taste and Pheromone Receptors. Neuron. 83, 850-865 (2014).
- Montell, C. A taste of the Drosophila gustatory receptors. Curr. Opin. Neurobiol. 19, 345-353 (2009).
- Shanbhag, S. R., Park, S. K., Pikielny, C. W., Steinbrecht, R. A. Gustatory organs of Drosophila melanogaster: fine structure and expression of the putative odorant-binding protein PBPRP2. Cell Tissue Res. 304, 423-437 (2001).
- Meunier, N., Marion-Poll, F., Rospars, J. P., Tanimura, T. Peripheral coding of bitter taste in Drosophila. J. Neurobiol. 56, 139-152 (2003).
- Rodrigues, V., Siddiqi, O. A gustatory mutant of Drosophila defective in pyranose receptors. Mol. Genet. Genomics. 181, 406-408 (1981).
- Hiroi, M., Meunier, N., Marion-Poll, F., Tanimura, T. Two antagonistic gustatory receptor neurons responding to sweet-salty and bitter taste in Drosophila. J. Neurobiol. 61, 333-342 (2004).
- Ling, F., Dahanukar, A., Weiss, L. A., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of taste coding in the legs of Drosophila. J. Neurosci. 34, 7148-7164 (2014).
- Delventhal, R., Kiely, A., Carlson, J. R. Electrophysiological recording from Drosophila labellar taste sensilla. J. Vis. Exp. , e51355 (2014).
- Meunier, N., Marion-Poll, F., Lansky, P., Rospars, J. P. Estimation of the individual firing frequencies of two neurons recorded with a single electrode. Chem. Senses. 28, 671-679 (2003).
- Masuyama, K., Zhang, Y., Rao, Y., Wang, J. W. Mapping neural circuits with activity-dependent nuclear import of a transcription factor. J. Neurogenet. 26, 89-102 (2012).
- Akerboom, J., et al. Crystal structures of the GCaMP calcium sensor reveal the mechanism of fluorescence signal change and aid rational design. J. Biol. Chem. 284, 6455-6464 (2009).
- Miyamoto, T., Chen, Y., Slone, J., Amrein, H. Identification of a Drosophila glucose receptor using Ca2+ imaging of single chemosensory neurons. PloS One. 8, e56304 (2013).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J. Neurosci. 32, 13819-13840 (2012).
- Shikichi, Y., et al. Pheromone synthesis. Part 250: Determination of the stereostructure of CH503 a sex pheromone of male Drosophila melanogaster, as (3R,11Z,19Z)-3-acetoxy-11,19-octacosadien-1-ol by synthesis and chromatographic analysis of its eight isomers. Tetrahedron. 68, 3750-3760 (2012).
- Yew, J. Y., et al. A new male sex pheromone and novel cuticular cues for chemical communication in Drosophila. Curr. Biol. 19, 1245-1254 (2009).
- Bray, S., Amrein, H. A putative Drosophila pheromone receptor expressed in male-specific taste neurons is required for efficient courtship. Neuron. 39, 1019-1029 (2003).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
- Kaissling, K. E., Zack Strausfeld, C., Rumbo, E. R. Adaptation processes in insect olfactory receptors. Mechanisms and behavioral significance. Ann. N. Y. Acad. Sci. 510, 104-112 (1987).
- Marder, E., Bucher, D. Central pattern generators and the control of rhythmic movements. Curr. Biol. 11, 986-996 (2001).
- Koepsell, K., Wang, X., Hirsch, J. A., Sommer, F. T. Exploring the function of neural oscillations in early sensory systems. Front Neurosci. 4, 53 (2010).
- Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature. 361, 315-325 (1993).
- Busch, K. E., et al. Tonic signaling from O(2) sensors sets neural circuit activity and behavioral state. Nat Neurosci. 15, 581-591 (2012).
