Ana Hücreleri ile Anaerobik Bakteriler Etkileşim değerlendirilmesi için bir model organizma olarak Porphyromonas gingivalis
Summary
This article presents two protocols: one to measure anaerobic bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize anaerobic bacteria interacting with host cells. This study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.
Abstract
Anaerobik bakteriler çok böyle gut, ağız ve vajina gibi birçok insan nişler aerop çoğunluktadır. Ayrıca, anaerobik enfeksiyonlar sık ve sık sık yerli kökenlidir. İnsan hücreleri istila bazı anaerobik patojenlerin yeteneğini onlara doğal bağışıklığı kaçmak için de konakçı hücre davranışını modüle edilmesi için bir tedbir alınması verir. Ancak, anaerobik bakteriler zorluklar oluşturabilecek olayların deneysel soruşturma sırasında canlı sağlanması olduğunu. Porphyromonas gingivalis, bir Gram-negatif anaerob, ökaryot fagositik olmayan hücrelere çeşitli işgal yeteneğine sahiptir. Bu makale başarıyla kültür ve P. yeteneğini değerlendirmek için nasıl özetliyor gingivalis, insan göbek damarı endotel hücreleri (HUVECler) işgal etmek. İki protokolleri geliştirilmiştir: Bir başarı istila ve ev sahibi içinde hayatta ve diğer konakçı hücreleri ile etkileşim bakteri görselleştirmek için bakteriler ölçmek için kullanılır. Bu teknikler, bir ANAE kullanımını zorunlurobic P. tedarik bölmesi Optimal büyüme için bir anaerobik ortam ile gingivalis.
Birinci protokol büyük ölçüde bakterilerin konakçı hücrelerin istilası incelemek için kullanılır antibiyotik koruma deneyi, dayanmaktadır. Bununla birlikte, antibiyotik koruma deneyi sınırlıdır; Antibiyotik tedavisi ve konak hücre lizis aşağıdaki kültürlenebilen sadece hücre içi bakteriler ölçülür. Canlı ve ölü konakçı hücreler ile etkileşen tüm bakteri değerlendirmek için, konukçu-patojen etkileşimini incelemek için flüoresan mikroskopi kullanan bir protokol geliştirilmiştir. Bakteriler flüoresan olarak, 2 'ile 7'-bis- (2-karboksietil) olarak etiketlenmiştir -5- (and-6) -carboxyfluorescein asetoksimetil ester (BCECF-AM) ve anaerobik koşullar altında ökaryotik hücrelerin enfeksiyonu için kullanılır. % 0.2 Triton X-100 ile formaldehit ve geçirgenliği ile tespit eden konakçı hücreler, sırasıyla, hücre sito-iskeletini ve çekirdeği etiketlemek için TRITC falloidinle ve DAPI ile etiketlenmiştir. Çoklu imaFarklı odak noktaları (Z-yığın) alınan ges bakterilerin zamansal-mekansal görselleştirme için elde edilir. Bu çalışmada kullanılan yöntemleri, herhangi bir ekilebilir anaerob herhangi bir ökaryotik hücre tipine uygulanabilir.
Introduction
Anaerobik bakteriler insan vücudunun hemen hemen tüm yüzeyleri kolonize. Oksijen konsantrasyonu düşüktür bağırsak ve genitoüriner yolun florasında baskın olmasına rağmen, aynı zamanda cilt, ağız, burun, boğaz ve 1 yüksek seviyelerde bulunmaktadır. Anaerobik bakteriler endojen enfeksiyon ortak bir nedenidir ve sıklıkla hastalıklı sitelerden izole edilmiştir. Bununla birlikte, bunların üreyen doğa anaeroblar izole etmek ve kültür, zor olabilir. Anaerobik bakteri içeren çalışmalar kısıtlı şartlarda yapılmalıdır. Modern anaerobik-kültür teknikleri araştırmacılar, birçok anaerobik laboratuar suşları ve hatta klinik izolatları 2,3 incelemek için gerekli olan anaerobik ayarlarını taklit izin verir.
Patojenik anaerobik bakteriler içinde bulundukları konakçı hücreler ile dinamik bir ilişki ve ko-evrim geliştirdik. En anaeroblar infecti ulaşmadan önce bir vücut bağışıklığı tepkisi ile öldürülmeye duyarlılı seviyeleri. Ancak, bazı patojen bakteriler kaçmak ya da konak immün yanıtı yıkmak için mekanizmalar geliştirmişlerdir. Bunlar, bağışıklık tanıma bağışıklık aracılarının nötralizasyon, hücre-aracılı bağışıklığın bir değişiklik, konakçı hücrelerin istilası ve 4 sinyal İmmün alterasyon kaçırma gibi mekanizmalarla bu amacı gerçekleştirmek. Porphyromonas gingivalis, hem oral hem de karışmış bir Gram-negatif anaerob ağız dışı hastalıklar, ev 5-7 patojen değişikliklerin neden olabilecek yüksek adapte bakteriyel patojenin bir örnektir.
Biyofilm plak cepler atmosferik oksijen 8 korunur anaerobik bakteri barındırabilir diş ve dişeti mukoza dokusunun arasında oluşan derin yarıklar oluşmuştur. Bunlar periodontal cepler gibi P. gibi çeşitli anaerobik patojenler, bir niş olarak hizmet gingivalis 9. P. gingivalis şeklini kapasitesine sahip bir kilit taşı patojendirPeriodontal hastalıkların 10 gelişmesini ve ilerlemesini teşvik şekillerde ağız mikrobiyal topluluk ing. Bu ana proteinlerin geniş bir spektrumuna karşı aktif olan ve ana savunma 11 kaçırma için mekanizmalar sağlar hastalık oluşturma faktörlerinin çok sayıda üretir. Aynı zamanda, in vitro ve in vivo 12-14 15 epitel, endotel, fibroblastik ve periodontal ligament hücreleri istila edebilir. Etkin bir şekilde, P. konakçı hücreleri işgal tarafından gingivalis konak bağışıklık kaçabilir. Konakçı hücrelerin etkili işgali sadece bakteri konak savunma kaçmasına izin değil, aynı zamanda gelecekte yeniden enfeksiyon için bir rezervuar olarak hizmet yanı sıra konakçı hücreyi değiştirir. Konakçı hücreler tarafından yapışması ve bakterinin içselleştirme yer alan moleküler mekanizmalar çalışmalar gereklidir. Birkaç laboratuvarlarda Araştırma P. içselleştirilmesi ile ilgili moleküler olayları anlamaya odaklanmıştır konakçı hücreler tarafından gingivalishem de bastırmak ve bağışıklık yanıtı kaçırmak ve düşman konak savunma mekanizmaları hayatta kalmak için kullanılan mekanizmalar olarak.
Tanımlanması ve konakçı hücreleri işgal edebilen patojenleri karakterize edebilen çok sayıda deneyler vardır. Oksijen yokluğunda hantal araçlara dayanan çalışmalar yapmak zor olduğundan Ancak, anaerobik patojenler ile in vitro çalışmalar ağırlıklı olarak araştırmacı birçok deneysel sorunlar oluşturmaktadır. Bu ökaryotik hücreler büyümeye oksijene ihtiyaç ve dolayısıyla doku kültürü inkübatörlerde ayrı hazırlanmış olmalıdır gerçeği ile birleşir. Bu tür engelleri önlemek için bir yolu atmosferik oksijenin altında çalışmalar yapmak olurdu, ama o anaerobik bakteri büyüme imkansız hale getirecektir. Başka bir yöntem, enfekte ve ana-hücre etkileşimini incelemek ısı ile öldürülmüş bakterilerin kullanmak olacaktır. Ancak, farklılıkların konak-patojen etkileflimlere alaka azaltmak ısı ile öldürülmüş ve canlı bakteri arasındaki mevcut16. Bu konak hücreleri ile etkileşim değişmeden ifade ile canlı bakteri incelemek için merkezi; P kültürlemek için, bu nedenle, yöntem anaerobik ortamda gingivalis verilmiştir. Aynı zamanda, iki basit düşük maliyetli protokoller P. yeteneğini değerlendirmek için gösterilmektedir gingivalis, insan göbek damarı endotel hücreleri (HUVECler) tarafından içselleştirilebilir için. Birinci protokol popüler antibiyotik koruma deneyi dayanmaktadır. Deney basittir, ancak anaerobik mikroorganizmalar kullanılarak hususlar verilmiştir. İkinci protokol etkileşim görselleştirmek için bir floresan tarama mikroskobu kullanılmasını gerektirir ve P. içsel gingivalis. Her deney sınırlamaları ve anaerobik bakteri invazivliğini eğitimi için araştırmacı bir taslağını sunmak üzere ele alınacak avantajlara sahiptir. Geçerli el yazması P çalışmaları olsa da gingivalis ve HUVECler, bu protokoller ve diğer pek çok anaerobik bakteriler için kullanılabilirEv sahibi hücre tiplerine olarak gösterilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yukarıdaki yöntemler eukaryotik hücreleri ile anaerobik bakteri ilişkinin değerlendirilmesi için özel bir tahlilleri tasarlamak için de kullanılabilir. Ancak, başarılı deneyler gerçekleştirmek için bazı noktalar vardır. İlk çalışmada kullanılan mikrobiyal soylar bulunmaktadır.
Bu, benzer bir büyüme aşamalarında ve invazyon verim 13 etkileyebilir yukarıda herhangi bir fark benzer hücre konsantrasyonları elde hayatta kalma tahlilinde hem de iki suşlar?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Dr. Hiroshi Miyazaki, Dr. Scott Henderson, Dr. Todd Kitten, Dr. Justin Hutcherson, Dr. Catherine Jauregui, and Collin R. Berry. This work was supported by NIH NIDCR grants R01DE016124, R01DE018039, and R01DE023304 to J.P. Lewis.
Microscopy was performed at the VCU Department of Anatomy and Neurobiology Microscopy Facility, supported, in part, with funding from NIH-NINDS Center core grant (5P30NS047463).
Materials
| Vinyl Anaerobic Chamber-Type B | Coy Laboratory Products | Model 2000 incubator | |
| TSA II Trypticase Soy Agar w/5% Sheep Blood | BBL | 221261 | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells 10-donor Pool | LifeLine Technology | FC-0044 | |
| VascuLife VEGF Medium Complete Kit | LifeLine Technology | LL-0003 | |
| TrypKit | LifeLine | LL-0013 | |
| Saponin | Riedel-de Haen | 16109 | |
| Gentamicin Sulfate Salt | Sigma-Aldrich | G-1264 | |
| Metronidazole | Sigma-Aldrich | M-3761 | |
| BCECF-AM | LifeTechnologies | B1150 | |
| TRITC Phalloidin | Sigma-Aldrich | P1951 | |
| 18 mm Circular Coverslips | Electron Microscopy Sciences | 72222-01 | |
| VectaShield Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 |
References
- Hentges, D. J. The Anaerobic Microflora of the Human Body. Clin. Infect. Dis. 16 (4), S175-S180 (1993).
- Willis, A. T. . Anaerobic bacteriology: clinical and laboratory practice. , (2014).
- Wren, M. W., Baldwin, A. W., Eldon, C. P., Sanderson, P. J. The anaerobic culture of clinical specimens: a 14-month study. J. Med. Microbiol. 10 (1), 49-61 (1977).
- Woolard, M. D., Frelinger, J. A. Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response. Immunol. Res. 41 (3), 188-202 (2008).
- Mayrand, D., Holt, S. C. Biology of asaccharolytic black-pigmented Bacteroides species. Microbiol. Rev. 52 (1), 134-152 (1988).
- Lamont, R. J., Jenkinson, H. F. Life below the gum line: pathogenic mechanisms of Porphyromonas gingivalis. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62 (4), 1244-1263 (1998).
- Haffajee, A. D., Socransky, S. S. Microbial etiological agents of destructive periodontal diseases. Periodontol. 2000. 5 (1), 78-111 (1994).
- Listgarten, M. A. Structure of the microbial flora associated with periodontal health and disease in man. A light and electron microscopic study. J. Periodontol. 47 (1), 1-18 (1976).
- Ximénez-Fyvie, L. A., Haffajee, A. D., Socransky, S. S. Comparison of the microbiota of supra- and subgingival plaque in health and periodontitis. J. Clin. Periodontol. 27 (9), 648-657 (2000).
- Darveau, R. P., Hajishengallis, G., Curtis, M. A. Porphyromonas gingivalis as a potential community activist for disease. J. Dent. Res. 91 (9), 816-820 (2012).
- Holt, S. C., Kesavalu, L., Walker, S., Genco, C. A. Virulence factors of Porphyromonas gingivalis. Periodontol. 2000. 20 (1), 168-238 (1999).
- Lamont, R. J., Yilmaz, &. #. 2. 4. 6. ;. Z. In or out: the invasiveness of oral bacteria. Periodontol. 2000. 30 (1), 61-69 (2002).
- Lamont, R. J., et al. Porphyromonas gingivalis invasion of gingival epithelial cells. Infect. Immun. 63 (10), 3878-3885 (1995).
- Belton, C. M., Izutsu, K. T., Goodwin, P. C., Park, Y., Lamont, R. J. Fluorescence image analysis of the association between Porphyromonas gingivalis and gingival epithelial cells. Cell. Microbiol. 1 (3), 215-223 (1999).
- Rautemaa, R., et al. Intracellular localization of Porphyromonas gingivalis thiol proteinase in periodontal tissues of chronic periodontitis patients. Oral Dis. 10 (5), 298-305 (2004).
- Kaufmann, S. H. Immunity to intracellular bacteria. Annu. Rev. Immunol. 11 (1), 129-163 (1993).
- Diaz, P., Rogers, A. The effect of oxygen on the growth and physiology of Porphyromonas gingivalis. Oral Microbiol. Immunol. 19 (2), 88-94 (2004).
- Lewis, J. P., Iyer, D., Anaya-Bergman, C. Adaptation of Porphyromonas gingivalis to microaerophilic conditions involves increased consumption of formate and reduced utilization of lactate. Microbiology. 155, 3758-3774 (2009).
- Edwards, A. N., Suarez, J. M., McBride, S. M. Culturing and maintaining Clostridium difficile in an anaerobic environment. J. Vis. Exp. (79), e50787 (2013).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr. Protoc. Immunol. , (2001).
- Koch, A. L., Crandall, M. Photometric measurement of bacterial growth. The American Biology Teacher. 30 (6), 481-485 (1968).
- Wikins, T. D., Holdeman, L. V., Abramson, I. J., Moore, W. E. Standardized single-disc method for antibiotic susceptibility testing of anaerobic bacteria Antimicrob. Agents Chemother. 1 (6), 451-459 (1972).
- Bauer, A. W., Kirby, W. M., Sherris, J. C., Turck, M. Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method. Am. J. Clin. Pathol. 45 (4), 493-496 (1966).
- Mandell, G. L. Interaction of intraleukocytic bacteria and antibiotics. J. Clin. Invest. 52 (7), 1673-1679 (1973).
- Menzies, B. E., Kourteva, I. Internalization of Staphylococcus aureus by endothelial cells induces apoptosis. Infect. Immun. 66 (12), 5994-5998 (1998).
- Naito, M., et al. Determination of the genome sequence of Porphyromonas gingivalis strain ATCC 33277 and genomic comparison with strain W83 revealed extensive genome rearrangements in P. gingivalis. DNA Res. 15 (4), 215-225 (2008).
- Goebel, W., Kuhn, M. Bacterial replication in the host cell cytosol. Curr. Opin. Microbiol. 3 (1), 49-53 (2000).
- Gospodarowicz, D. C. Extracellular matrix and control of proliferation of vascular endothelial cells. J. Clin. Invest. 65 (6), 1351-1364 (1980).
- DeQuach, J. A., et al. Simple and high yielding method for preparing tissue specific extracellular matrix coatings for cell culture. PloS One. 5 (9), e13039 (2010).
- Sellers, J. R., Cook, S., Goldmacher, V. S. A cytotoxicity assay utilizing a fluorescent dye that determines accurate surviving fractions of cells. J. Immunol. Methods. 172 (2), 255-264 (1994).
- Van Veen, H. W., et al. Generation of a proton motive force by the excretion of metal-phosphate in the polyphosphate-accumulating Acinetobacter johnsonii strain 210A. J. Biol. Chem. 269 (47), 29509-29514 (1994).
- Jackson, V. N., Halestrap, A. P. The kinetics, substrate, and inhibitor specificity of the monocarboxylate (lactate) transporter of rat liver cells determined using the fluorescent intracellular pH indicator, 2′,7′-bis(carboxyethyl)-5(6)-carboxyfluorescein. J. Biol. Chem. 271 (2), 861-868 (1996).
- He, J., et al. Role of Porphyromonas gingivalis FeoB2 in metal uptake and oxidative stress protection. Infect. Immun. 74 (7), 4214-4223 (2006).
- Anaya-Bergman, C., et al. Porphyromonas gingivalis ferrous iron transporter FeoB1 influences sensitivity to oxidative stress. Infect. Immun. 78 (2), 688-696 (2010).
- Ueshima, J., et al. Purification, gene cloning, gene expression, and mutants of Dps from the obligate anaerobe Porphyromonas gingivalis. Infect. Immun. 71 (3), 1170-1178 (2003).
- Johnson, M. B., Criss, A. K. Fluorescence microscopy methods for determining the viability of bacteria in association with mammalian cells. JoVE. (79), (2013).
- Cordes, T., Maiser, A., Steinhauer, C., Schermelleh, L., Tinnefeld, P. Mechanisms and advancement of antifading agents for fluorescence microscopy and single-molecule spectroscopy. Physical Chemistry Chemical Physics. 13 (14), 6699-6709 (2011).
- Pawley, J. . Handbook of biological confocal microscopy. , (2010).
- Gursoy, U., Könönen, E., Uitto, V. Prevotella intermedia ATCC 25611 targets host cell lamellipodia in epithelial cell adhesion and invasion. Oral Microbiol. Immunol. 24 (4), 304-309 (2009).
- Sengupta, D., et al. Interaction of Prevotella intermedia strain 17 leucine-rich repeat domain protein AdpF with eukaryotic cells promotes bacterial internalization. Infect. Immun. 82 (6), 2637-2648 (2014).
- Reyes, L., Herrera, D., Kozarov, E., Roldán, S., Progulske-Fox, A. Periodontal bacterial invasion and infection: contribution to atherosclerotic pathology. J. Clin. Periodontol. 40, S30-S50 (2013).
- Grant, M. M., et al. Oxygen tension modulates the cytokine response of oral epithelium to periodontal bacteria. J. Clin. Periodontol. 37 (12), 1039-1048 (2010).
- Biedermann, A., Kriebel, K., Kreikemeyer, B., Lang, H. Interactions of Anaerobic Bacteria with Dental Stem Cells: An In Vitro Study. PloS One. 9 (11), e110616 (2014).
- Kriebel, K., Biedermann, A., Kreikemeyer, B., Lang, H. Anaerobic Co-Culture of Mesenchymal Stem Cells and Anaerobic Pathogens-A New In Vitro Model System. PloS One. 8 (11), e78226 (2013).
- Peyyala, R., Kirakodu, S. S., Novak, K. F., Ebersole, J. L. Oral microbial biofilm stimulation of epithelial cell responses. Cytokine. 58 (1), 65-72 (2012).
- Halldorsson, S., Lucumi, E., Gòmez-Sjöberg, R., Fleming, R. M. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosens Bioelectro. 63, 218-231 (2015).
- Iyer, D., et al. AdpC is a Prevotella intermedia 17 leucine-rich repeat internalin-like protein. Infect. Immun. 78 (6), 2385-2396 (2010).
