Abstract
Les bactéries anaérobies sont beaucoup plus nombreux aérobies dans de nombreuses niches humaines telles que l'intestin, de la bouche et le vagin. En outre, les infections anaérobies sont fréquents et souvent d'origine indigène. La capacité de certains agents pathogènes anaérobies à envahir les cellules humaines leur donne des mesures d'adaptation pour échapper à l'immunité innée, ainsi que pour moduler le comportement de la cellule hôte. Cependant, veiller à ce que les bactéries anaérobies sont en direct pendant l'enquête expérimentale des événements peuvent poser des problèmes. Porphyromonas gingivalis, un anaérobie à Gram négatif, est capable d'envahir une variété de cellules non-phagocytaires eucaryotes. Cet article décrit comment réussir à la culture et d'évaluer la capacité de P. gingivalis à envahir les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC). Deux protocoles ont été développés: de mesurer les bactéries qui peuvent survivre avec succès envahir et à l'intérieur de l'hôte, et l'autre pour visualiser les bactéries qui interagissent avec les cellules hôtes. Ces techniques nécessitent l'utilisation d'un anaechambre pour fournir P. Robic gingivalis avec un milieu anaérobie pour une croissance optimale.
Le premier protocole est basé sur le test de protection aux antibiotiques, qui est largement utilisé pour étudier l'invasion des cellules hôtes par des bactéries. Toutefois, l'essai de protection antibiotique est limité; seules les bactéries intracellulaires qui sont cultivables et après un traitement antibiotique de lyse de la cellule hôte sont mesurées. Pour évaluer toutes les bactéries interagissent avec les cellules hôtes, à la fois vivants et morts, nous avons développé un protocole qui utilise la microscopie à fluorescence pour examiner l'interaction hôte-pathogène. Les bactéries sont marquées par fluorescence avec la 2 ', 7'-bis- (2-carboxyéthyl) -5- (et-6) -carboxyfluorescéine acétoxyméthyl ester (BCECF-AM) et utilisé pour infecter des cellules eucaryotes dans des conditions anaérobies. Suite à la fixation avec du paraformaldehyde et perméabilisation avec 0,2% de Triton X-100, les cellules hôtes sont marqués avec DAPI et TRITC phalloïdine pour marquer le cytosquelette de la cellule et du noyau, respectivement. Multiple images prises à différents points focaux (Z-Stack) sont obtenus pour la visualisation spatio-temporelle des bactéries. Les méthodes utilisées dans cette étude peuvent être appliqués à n'importe quel anaérobie cultivable et n'importe quel type de cellule eucaryote.
Introduction
Les bactéries anaérobies colonisent presque toutes les surfaces du corps humain. Bien prédominant dans la flore intestinale des voies génito-urinaires et où les concentrations d'oxygène sont faibles, ils existent également à des niveaux élevés sur la peau, de la bouche, du nez et de la gorge 1. Les bactéries anaérobies sont une cause fréquente d'infections endogènes et sont fréquemment isolés à partir de sites malades. Toutefois, en raison de leur nature fastidieuse, anaérobies peuvent être difficiles à isoler et à la culture. Les études portant sur les bactéries anaérobies doivent être effectuées dans des conditions restreintes. Techniques anaérobie-culture moderne permettent aux chercheurs d'imiter les paramètres anaérobies nécessaires à l'étude de nombreuses souches de laboratoire anaérobie ou même des isolats cliniques 2,3.
Des bactéries anaérobies pathogènes ont développé une relation dynamique et co-évolution avec les cellules de l'hôte dans lequel ils résident. La plupart des bactéries anaérobies sont sensibles à la destruction par la réponse immunitaire de l'hôte avant d'atteindre infectiniveaux UO. Cependant, certaines bactéries pathogènes ont développé des mécanismes pour échapper à ou dénaturer la réponse immunitaire de l'hôte. Ils atteindre cet objectif par le biais de mécanismes tels que l'évasion de la reconnaissance immunitaire, neutralisation des médiateurs immunitaires, l'altération de l'immunité à médiation cellulaire, l'invasion des cellules hôtes, et la modification de la signalisation 4 immunitaire. Porphyromonas gingivalis, un anaérobie à Gram négatif impliquées à la fois orale et maladies, extra- est un exemple d'un agent pathogène bactérien très adapté capable de provoquer des changements pathogènes chez l'hôte 7.5.
Des poches de la plaque de biofilm courus dans de profondes crevasses formées entre les dents et le tissu muqueux gingival peuvent abriter des bactéries anaérobies qui sont protégés de l'oxygène atmosphérique 8. Ces poches parodontales servir de niche de divers agents pathogènes anaérobies, telles que P. 9 gingivalis. P. gingivalis est un agent pathogène de la distorsion qui est capable de remodelering la communauté microbienne buccale de manière à promouvoir le développement et la progression des maladies parodontales 10. Elle produit un grand nombre de facteurs de virulence qui sont actifs contre un large spectre de protéines de l'hôte et fournit des mécanismes pour l'évasion de 11 défenses de l'hôte. Il est également capable d'envahir épithéliales, endothéliales, fibroblastes et les cellules du ligament parodontal in vitro et in vivo de 12 à 14 15. En envahissant efficacement les cellules de l'hôte, P. gingivalis peut échapper à l'immunité de l'hôte. Invasion efficace de cellules hôtes non seulement permet à la bactérie de se échapper défenses de l'hôte, mais sert également de réservoir pour l'avenir ré-infection ainsi que modifie la cellule hôte. Des études sur les mécanismes moléculaires impliqués dans l'adhésion et l'internalisation de la bactérie par des cellules hôtes sont nécessaires. Recherche dans plusieurs laboratoires se concentre sur la compréhension des événements moléculaires associés à l'internalisation de P. gingivalis par les cellules hôtesainsi que les mécanismes utilisés pour réprimer et détourner la réponse immunitaire et survivre aux mécanismes de défense de l'hôte hostiles.
Il existe de nombreux dosages capables d'identifier et de caractériser des agents pathogènes qui sont capables d'envahir les cellules hôtes. Cependant, des études in vitro avec des agents pathogènes anaérobies posent de nombreux problèmes expérimentaux pour le chercheur, principalement parce qu'il est difficile de réaliser des études qui reposent sur des instruments encombrants en l'absence d'oxygène. Cette situation est aggravée par le fait que les cellules eucaryotes besoin d'oxygène pour se développer et doivent donc être préparés séparément dans des incubateurs de culture de tissus. Une façon d'éviter ces obstacles serait d'effectuer les études sous oxygène atmosphérique, mais ce serait faire de la croissance de bactéries anaérobies impossible. Une autre méthode serait d'utiliser des bactéries tuées par la chaleur à infecter et à étudier les interactions de la cellule hôte. Cependant, des différences existent entre les bactéries tuées par la chaleur et viables qui diminuent la pertinence de la interacti hôte-pathogènele 16. Il est central pour étudier les bactéries viables avec l'expression inchangé interagir avec des cellules hôtes; par conséquent, des procédés pour cultiver P. gingivalis dans un cadre anaérobie sont donnés. En outre, deux protocoles rentables simples sont démontrées pour évaluer la capacité de P. gingivalis à être internalisée par les cellules humaines ombilicales veineuses endothéliales (HUVEC). Le premier protocole est basé sur le dosage de protection populaire antibiotique. Bien que le test est simple, les considérations lors de l'utilisation de micro-organismes anaérobies sont donnés. Le deuxième protocole nécessite l'utilisation d'un microscope à fluorescence à balayage visualiser et interagir internalisé P. gingivalis. Chaque test a ses limites et avantages qui seront discutés de fournir au chercheur un aperçu pour l'étude de l'envahissement de bactéries anaérobies. Bien que le manuscrit en cours étudie P. gingivalis et HUVECs, ces protocoles peuvent être utilisés pour de nombreuses autres bactéries anaérobies ainsique pour les autres types de cellules hôtes.
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Protocol
Les protocoles suivants décrivent des procédés de mise en culture et l'étude de l'invasion par les espèces anaérobies, P. gingivalis; Toutefois, ces protocoles peuvent être utilisés pour un certain nombre d'agents pathogènes anaérobies. Bien HUVECs sont utilisés, ce protocole peut être utilisé pour d'autres cellules eucaryotes fois immunitaires et non immunitaires.
1. anaérobie Chambre utilisation et d'entretien
Remarque: P. gingivalis est un anaérobie sensibles à des niveaux normaux d'oxygène rencontrées dans l'air ambiant. Un environnement anaérobie contrôlé est essentiel pour la culture de P. gingivalis.
- Ici, maintenir une atmosphère artificielle désigné comme gaz anaérobie mixte (80% de N 2, 10% de H2, 10% CO 2) dans une chambre anaérobie de vinyle (figure 1A). Utiliser un sas (figure 1B) pour transférer des objets dans l'environnement du laboratoire de la chambre anaérobie. Le sas fonctionne manuellement, twpurge de la glace avec du gaz N 2 avant d'introduire le gaz anaérobie mixte.
- Utilisation d'une colonne d'élimination de sulfure d'hydrogène (Figure 1C) pour l'enlèvement d'entretien de l'hydrogène sulfuré indésirable. Placer un déshumidificateur dans la chambre pour éliminer H 2 O créé par le catalyseur et d'éviter les aérosols qui facilitent la propagation de la contamination.
Remarque: Le sulfure d'hydrogène est un sous-produit métabolique naturel de nombreuses bactéries anaérobies et son accumulation est toxique pour les bactéries et peut entraîner des dommages à l'électronique et de diminuer la durée de vie d'un catalyseur. - Utiliser une boîte de ventilateur pour faire circuler l'atmosphère de la chambre à travers un catalyseur au palladium, ce qui élimine l'oxygène en présence d'hydrogène (figure 1D).
Remarque: Une atmosphérique (HEPA) faire recirculer l'air élimine les contaminants d'une taille de 0,22 pm ou plus. - Culture bactéries anaérobies dans un incubateur à 37 ° qui se trouve à l'intérieur de l'anaérobiechambre. Utilisez des techniques aseptiques standards lorsque vous travaillez à l'intérieur de la chambre anaérobie.
Figure 1. chambre anaérobie de vinyle et ses composants. (A) une chambre anaérobie de vinyle scellé complètement à partir de l'oxygène atmosphérique fournit espace de travail pour deux personnes à la fois (en 32 x 78 in). Il contient un incubateur réglé à 37 ° C (milieu du dos). (B) un sas est utilisé pour le transfert des objets dans l'environnement de laboratoire à la chambre anaérobie. Sur la photo, un sas automatique commandé par un contrôleur qui peut être programmé pour exécuter automatiquement les procédures de vide et de purge nécessaires pour créer un environnement anaérobie. (C) Un sulfure d'hydrogène colonne d'élimination fournit haute capacité élimination sans entretien des indésirables du sulfure d'hydrogène. (D) Deux boîtes de ventilateur de catalyseur sontplacé dans toute la chambre anaérobie pour faire circuler l'atmosphère de la chambre à travers un catalyseur au palladium, ce qui, en présence d'hydrogène, élimine l'oxygène. La chambre anaérobie est mis en place selon les instructions du fabricant. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
2. Préparation des bactéries anaérobies
Remarque: P. gingivalis est aérotolérants et peut être stocké dans des conditions aérobies, mais il ne sera pas croître en présence d'oxygène à des niveaux plus élevés de 6% 17,18. Une chambre anaérobie est nécessaire pour la bonne culture de P. gingivalis et d'autres espèces anaérobies (figure 1). Une bonne formation et d'éducation sur l'utilisation de la chambre anaérobie est nécessaire avant de travailler avec microanaerobes 19.
- Equilibrer tous les milieux liquides et des plaques à condit anaérobieions pendant au moins 12 heures avant l'expérimentation pour éliminer l'oxygène résiduel.
- Transfert P. gingivalis de -80 ° C congélateur chambre anaérobie, laisser décongeler.
- Streak P. gingivalis sur des plaques de gélose au sang de soja trypticase (TSA II avec du sang de mouton à 5%). Enveloppez plaques en parafilm et conserver à 37 ° C dans un incubateur anaérobie pendant 4-7 jours.
- Inoculer P. gingivalis dans 3 perfusion cardiaque ml du cerveau (BHI) complétées par hémine et ménadione, un milieu liquide non-sélectifs enrichis pour l'isolement et la culture de micro-organismes anaérobies et fastidieux, en utilisant des boucles stériles.
Remarque: Pour le stockage à long terme, mélanger les cultures bactériennes préparés BHI avec le glycérol ou DMSO (10-20% concentration finale) et placer dans un congélateur à -80 ° C. - Préparer une culture de départ de P. gingivalis en faisant une dilution 1:10 et permet aux bactéries de croître jusqu'à la phase mid-log.
Note: La densité optique du bacsuspension TÉRIAU est déterminé et la concentration pour chaque souche bactérienne à examiner est ajustée. Pour P. gingivalis une suspension à DO 660 de 0,7 correspond à la phase mi-log et ~ 7 x 10 8 cellules / ml. Les conditions de croissance décrites dans le protocole ci-dessus sont spécifiques de P. gingivalis et peuvent avoir besoin d'être adapté pour d'autres souches bactériennes.
3. cellules endothéliales Culture
Remarque: Achat regroupé HUVECs primaires et de la culture en milieu de base contenant des facteurs de croissance endothéliaux vasculaires (VEGF) à 37 ° C dans 5% de CO 2 selon les instructions du fabricant.
- HUVECs de semences en flacons T-75 à 2,5 x 10 5 cellules / flacon dans 15 ml médias VEGF.
Remarque: Vérifiez la viabilité par une dilution 1: 1 avec 4,0% de bleu trypan. Les cellules avec une membrane compromis conservera bleu trypan, les cellules saines avec des membranes intactes apparaîtront blanches lorsqu'elles sont visualisées sous un microscope optique binoculaire. ConT 100 cellules, en sorte que plus de 80% des cellules sont viables 20. - Remplacez le support tous les 2 jours avec les médias préchauffé VEGF fraîche jusqu'à ce que les cellules atteignent ~ 80% de confluence.
- Laver les cellules une fois avec PBS préchauffé. Libérer les cellules de la fiole T75 par incubation avec 2 ml de trypsine-EDTA (0,25%) pendant 5 min, suivie de neutralisation par une solution de 2 ml de trypsine.
- Recueillir HUVEC en suspension dans un tube conique de 50 ml. Laver toutes les cellules supplémentaires à partir de flacons T-75 avec du PBS et 50 ml de transférer des tubes coniques.
- Centrifuger les cellules à 200 g pendant 10 min.
- Retirer le surnageant, suspendre culot cellulaire dans 10 ml de médias de VEGF préchauffé.
- Déterminer la concentration cellulaire en utilisant un hémocytomètre ou similaire dispositif de comptage cellulaire.
- Calcul du montant de la suspension cellulaire à ajouter à soit plaque de 6 puits (400 000 / puits) ou une plaque de 12 puits avec des lamelles (50 000 / puits). HUVECs sera prêt pour l'expérimentation le lendemain.
4. Essai de survie Invasion / Interaction(Placage)
Remarque: Lorsque vous effectuez ce test, préparer deux plaques de cellules endothéliales ensemencées à 400.000 cellules / puits 6 puits. Une plaque sera utilisée pour évaluer bactéries fixées à internalisés et par des cellules hôtes. L'autre plaque représentera pour les bactéries intracellulaires. La plaque de 6 puits permet en triple de deux échantillons à être effectuées en une seule expérience. Pour un aperçu de ce protocole s'il vous plaît se référer à l'analyse de la survie organigramme (Figure 2).
- Préparer des bactéries anaérobies comme décrit ci-dessus (voir la section 1) jusqu'à ce qu'ils atteignent la croissance mi-log (OD 660 0,5-0,7).
- Bactéries centrifuger à 5000 g pendant 10 min.
Remarque: Si la centrifugeuse est en dehors de la chambre anaérobie, porter échantillons bactériens dans un tube de 15 ml hermétiquement fermés, enveloppez le bouchon avec du parafilm pour éviter les fuites d'oxygène. - Placez granulés P. gingivalis retour dans la chambre, éliminer le surnageant. Laver avec du PBS, les bactéries de granulés de nouveau avant remise en suspension dans VEGF-moidia. Préparer des suspensions pour toutes les souches bactériennes à tester à une DO 660 de 0,7 qui correspond à la phase mi-log (environ 7 x 10 8 cellules / ml). Les bactéries sont maintenant prêts pour l'infection.
- Transfert des plaques à 6 puits contenant des cellules HUVEC à partir de tissu en culture incubateur. Chambre anaérobie Retirez le support et laver trois fois avec PBS anaérobie. Ajouter 2 ml de milieu de VEGF anaérobie dans chaque puits et placer les plaques à 37 ° C dans l'incubateur anaérobie pendant 20 minutes pour équilibrer la température de l'infection.
Remarque: les bactéries de plaque sur des plaques d'agar de sang pour assurer ceux utilisés pour l'infection sont homogènes et non contaminés lors de l'infection. - Infecter les cellules hôtes avec des bactéries à une multiplicité d'infection (MOI: bactéries hôtes) de 100: 1.
Remarque: le nombre de cellules HUVEC est déterminé en effectuant un test d'exclusion trypan sur un seul bien avant l'infection. Le nombre de cellules bactériennes est déterminé par la densité optique (par exemple, de 0,5 OD = 5 x 10 8 cellules / ml). Bacterial concentration est ajustée à bon MOI basée sur la concentration HUVECs 21. - Placer plaques de 6 puits avec des cellules HUVEC infectées en incubateur anaérobie et les bactéries permettent d'interagir avec les cellules hôtes pendant 30 min.
- Préparation de saponine dans du BHI (1,0% p / v) à l'intérieur de la chambre anaérobie et filtrer à travers un filtre de 0,2 um.
- La survie de deux bactéries fixées et intériorisées.
- Retirer les plaques de l'incubateur, les médias aspirer, laver trois fois avec PBS anaérobie et ajouter 2 ml filtrés 1,0% de saponine (préparé comme décrit dans l'étape 4.8). Incuber pendant 15 min pour permettre la lyse de la cellule hôte.
- Racler fond de chaque puits avec un grattoir à cellules. Recueillir le mélange de cellules de chaque puits et faire une dilution de 1: 1 dans du BHI.
- Passez à réaliser des dilutions de l'échantillon. Selon les espèces bactériennes et de la concentration, de régler des dilutions en série. Commencez avec 1: 100 ou 1: 1000 dilutions.
- Plaque 200 ul de la dilution souhaitée sur des plaques de gélose au sang. Wrap til plaques en parafilm et placer dans l'incubateur anaérobie à 37 ° C.
- Après sept jours d'incubation à 37 ° C, retirer les plaques et à compter unités formant colonie (UFC) en utilisant une boîte à lumière de compter manuellement colonies.
Remarque: UFC sont énumérés. Pour de plus grandes quantités de UFC, les images peuvent être prises et des logiciels peuvent être utilisés pour faciliter le dénombrement des UFC.
- La survie des bactéries internalisées.
- Retirer les plaques de l'incubateur. Laver trois fois avec du PBS et anaérobie ajouter 2 ml de milieux de VEGF avec additionné d'antibiotiques (300 pg / ml de gentamicine et de 400 ug / ml de métronidazole).
- Incuber pendant 1 heure. Veillez à tester les antibiotiques de sorte qu'ils sont 100% efficace pour tuer la souche bactérienne désirée et assurez-vous qu'ils ne pénètrent pas dans les cellules hôtes 22,23.
- Aspirer le milieu, ajouter 2 mL de 1,0% filtrée saponine. Incuber pendant 15 min pour permettre la lyse de la cellule hôte.
- Racler le fond de chaque well avec racleur de cellules. Recueillir le mélange de cellules de chaque puits et faire dilution 1: 1 dans du BHI.
- Préparer des dilutions en série de l'échantillon (1: 100, 1: 1000).
- Plaque 200 ul de la dilution souhaitée sur des plaques de gélose au sang. Enveloppez plaques en parafilm et placer dans un incubateur anaérobie.
- Après sept jours d'incubation à 37 ° C enlever les plaques et à compter UFC.
Figure 2. Représentation schématique d'un protocole utilisé pour la survie des bactéries anaérobies avec des cellules eucaryotes. Les deux tests pour une survie bactérienne totale et la survie des bactéries intériorisées peuvent être effectuées en même temps. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
5. L'internalisation des bactéries dans This HostLLS (microscopie à fluorescence)
Remarque: P. gingivalis est marqué avec la 2 ', 7'-bis- (2-carboxyéthyl) -5- (et-6) -carboxyfluorescéine, acétoxyméthyl ester (BCECF-AM). BCECF-AM est un colorant de membrane perméable non fluorescent; BCECF sa conversion en fluorescéine sous l'action des esterases intracellulaires de peut indiquer la viabilité cellulaire. P. gingivalis est marqué avec le colorant BCECF-AM et ensuite utilisé pour infecter des cellules eucaryotes. Après l'infection, les cellules sont fixées et marquées au DAPI et TRITC-phalloïdine. La tache de DAPI utilisé pour colorer le noyau de la cellule eucaryote sera également étiqueter noyau de la cellule bactérienne, qui fournit une contre-mesure pour identifier les bactéries non viables qui ne peuvent pas métaboliquement cleave BCECF-AM. Les cellules hôtes sont mises en évidence par la phalloïdine-TRITC, un colorant rouge de l'actine.
- Lamelles autoclave. Ajouter stérilement lamelles à plaques à 12 puits avant de semer les cellules endothéliales à 5 x 10 4 cellules / puits. (Journée Préparé avant l'expérience)
- Préparer bactéries anaérobies cultivées jusqu'à la phase mid-log (OD 660 = 0,5-0,7) comme décrit dans l'article 1.
- Laver les bactéries anaérobies 2x avec du PBS par centrifugation à 5000 xg et de mise en suspension le culot dans du PBS à 5-7 x 10 8 cellules / ml.
- Ajouter 20 ul de 0,2 mM de BCECF-AM à 2 ml de suspension bactérienne (5-7 x 10 8 cellules / ml) jusqu'à une concentration finale de BCECF-AM de 2 uM.
- Incuber à 37 ° C pendant 30 min dans l'obscurité.
- Des plaques de transfert avec les cellules endothéliales ensemencées sur 18 mm (# 1.5) d'épaisseur des lamelles circulaires de culture de tissu dans la chambre incubateur anaérobie. Laver avec du PBS et l'échange avec les médias de VEGF anaérobie.
Remarque: Vérifiez que HUVECs sont en bonne santé sous un microscope optique. HUVEC devrait être ~ 80% de confluence, la morphologie devrait être comparable à des fabricants. - Centrifuger étiqueté à bactéries5000 xg pendant 10 min pour éliminer le colorant résiduel BCECF-AM. Mettre en suspension dans 2 ml de milieu de VEGF anaérobie.
- Infecter les cellules hôtes avec des bactéries marquées à MOI de 100: 1 (bactéries: accueil).
- Incuber à chambre anaérobie à 37 ° C pendant 30 min.
- Après que les cellules de lavage de l'infection avec PBS trois fois et fixer fraîchement préparée 4,0% de paraformaldehyde pendant 10 min.
Remarque: Après que les cellules de fixation, l'expérience peut être menée à l'extérieur de la chambre anaérobie. - Laver avec lamelles de PBS à trois reprises.
- Ajouter 1 ml de 0,2% de Triton X-100 pendant 10 min.
- Laver avec lamelles de PBS à trois reprises.
- Ajouter 50 ul de TRITC phalloïdine (50 ug / ml) à lamelles pendant 45 minutes.
- Lavez lamelles de trois fois, retirer de la plaque de 12 puits et les placer sur une diapositive avec soft-jeu milieu de montage contenant DAPI. Sceller les côtés avec du vernis à ongles.
Remarque: Les lames peuvent être stockées pendant quelques mois dans l'obscurité. Évitez exposition à la lumière pour éviter photo-blanchiment. - Voir les diapositivesen utilisant un microscope confocal.
- Ici, utilisez un système 34 de canal spectrale (détecteur de réseau 32-canal et deux détecteurs de PMT de côté, plus un détecteur de lumière transmise) configuré autour d'un AxioObserver (inversé) stand avec un étage XY motorisé. Le système dispose de cinq lasers: diode bleue (405 nm), multi-ligne Argon (458, 488, 514 nm), diode verte (561 nm), rouge HeNe (633 nm) et un laser pulsé 440 nm. Équipé d'un système d'imagerie de vie de fluorescence avec 2 détecteurs de GaAsP hybrides (pour FRET-FLIM).
- Détecter la fluorescence à partir de DAPI et TRITC dans une chaîne à l'aide d'un filtre bi-bande avec des longueurs d'onde d'excitation de 340-380 nm et 540-560 nm, et un filtre d'émission de 435-485 nm et 570-590 nm, respectivement. Détecter la fluorescence de BCECF-AM en utilisant un filtre avec une excitation longueur d'onde de 440-500 nm et un filtre d'émission de 510 à 590 nm.
Remarque: Les commandes de BCECF-AM doivent être effectuées sur chaque souche bactérienne à l'étude pour assurer l'étiquetage approprié des bactéries viables. Première valider que nonviabLe bactéries sont DAPI-positif et BCECF négatif. Deuxièmement, veiller à ce que des bactéries vivantes peuvent métaboliser BCECF-AM dans la fluorescéine BCECF. Peut-être besoin d'être testés pour l'étiquetage optimale des concentrations variables de bactéries ou BCECF-AM colorant.
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Representative Results
Protocoles décrits ci-dessus ont été utilisés dans l'étude de l'interaction hôte-pathogène entre P. gingivalis et les cellules endothéliales. P. gingivalis W83 et une p gingivalis V3150 portant une délétion de PG0228 ont été utilisés dans l'étude. Le PG0228 est prédit pour coder pour une protéine susceptible de modifier les niveaux d'ARN et de protéines, qui peuvent en fin de compte affecter l'interaction de P. gingivalis avec les cellules hôtes. Pour étudier l'effet de PG0228 sur P. capacité d'interagir avec les cellules hôtes de gingivalis, la capacité des souches mutantes et parentales pour interagir avec des cellules HUVEC a été comparée. Le protocole de survie (figure 2) a été appliqué à cette étude. Ainsi, les deux souches ont été cultivées jusqu'à la phase logarithmique, comme indiqué à l'étape 2. Les deux souches ont des courbes de croissance similaires, et donc pas de problèmes significatifs avec normalisation des nombres de cellules avant l'infection a été détectée. Après sept jours d'incubation, CFU ont été observés sur le sang d'unplaques gar (Figure 3). Plusieurs dilutions 1:10 (figure 3A), 1: 100 (figure 3C) et 1: 1 000 (Figure 3B) ont été étalées sur des plaques de gélose au sang. Comme on le voit dans la figure 3A, le nombre de colonies étaient trop élevés à évaluer; les colonies étaient indiscernables les uns des autres et désigné comme «trop pour les compter» [TMTC]. La dilution dans la figure 3B était trop bas que sont obtenus trop peu de colonies. Les dilutions de 1: 100, comme illustré sur la figure 3C est souhaitable, que les colonies sont discernables et le nombre de colonies ont pu être gérées à compter. Des résultats similaires ont été trouvés pour la souche mutante V3150 (Figure 3D). Ainsi, le CFU ont été dénombrés à partir des plaques avec le facteur de dilution de 1: 100.
En utilisant le nombre d'UFC et le facteur de dilution, le nombre estimatif de bactéries viables récupérés pour chaque souche a été calculé. Divisant le nombre de viable bactéries récupérées par le nombre initial de bactéries résultats dans un rapport défini comme étant le rendement de l'invasion. En comparant les rendements de l'invasion des deux souches, de type sauvage W83 survécu dans les HUVEC avec une grande efficacité, tout souches dépourvues PG0228 a montré une réduction significative de la survie (Figure 4).
Pour vérifier en outre que le défaut est dû à la survie réduite plutôt que l'internalisation de la bactérie, l'analyse microscopique a été effectuée. HUVECs infectés par P. gingivalis ont été vues au microscope (Figure 5). Dans cet exemple, une HUVEC est présentée. Pour déterminer le nombre de bactéries intériorisées plusieurs images ont été prises à des distances focales différentes pour obtenir un Z-pile permettant l'identification spatio-temporelle des intériorisé P. gingivalis. En outre, au moins 40 cellules / expérience doivent être analysés (pour chaque récipient biologique) et le nombre de bactéries intériorisées énumérés pour chaque stpluie. Si le nombre de bactéries internalisées est la même pour chaque souche lorsqu'on les observe au microscope, puis les deux souches envahissent également HUVEC; cependant, le mutant a permis de réduire V3150 capacité de survivre tandis que l'intérieur de la cellule hôte comme on le voit dans le test de protection aux antibiotiques.
Figure 3. Résultats d'une analyse de la survie des bactéries. Protocole pour la survie des bactéries intracellulaires a été utilisé pour évaluer la capacité de type sauvage P. gingivalis W83 et un déficient V3150 mutant dans PG0228 d'envahir et de survivre dans HUVECs. Bactéries viables intériorisées sont déterminées par la visualisation d'UFC après une incubation de HUVECs- P. gingivalis mélange sur des plaques d'agar de sang de sept jours dans des conditions anaérobies. Plaques de sang sont placés sur la boîte de lumière qui augmente le contraste et permet de faciliter le comptage de l'UFC. Diverses dilutions étaient examined. HUVECs infectés par P. gingivalis W83 dilution 1:10 (A), dilution 1: 1000 (B), et la dilution 1: 100 (C). HUVECs infectés par P. gingivalis V3150 dilution 1:. 100 (D) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Comparaison d'un taux de survie entre des souches bactériennes parentales et mutantes. HUVEC ont été infectés par type sauvage P. gingivalis W83 et un mutant déficient en V3150 PG0228. Protocole pour la survie, comme indiqué dans la figure 2 a été suivie. Expérience a été réalisée trois fois en triple et la moyenne ± écart-types sont présentés. Invasion représente l'efficacité / survécu bactéries initiales.* La souche mutante a statistiquement significative la survie réduite par rapport à la souche de type sauvage W83 (P <0,05). S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. Exemple d'une analyse microscopique de P. gingivalis intériorisées par HUVECs. HUVEC ont été infectées par BCECF-AM marqué P. gingivalis pendant 30 min à une MOI de 100: 1 (P. gingivalis: HUVEC). Les cellules ont été fixées avec du paraformaldéhyde et étiquetés avec TRITC-phalloïdine et DAPI. L'image montre un seul HUVEC avec le noyau (A) et F-actine (B) colorées en bleu et rouge, respectivement. La flèche indique P. gingivalis étiqueté vert (C). Un ima fusionnéeGE est produite pour montrer P. invasion gingivalis dans des cellules HUVEC (D). Les images ont été produites en utilisant microscope confocal à balayage. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Tous les procédés ci-dessus peuvent être utilisées pour concevoir des dosages spécifiques pour évaluer l'interaction entre les bactéries anaérobies avec des cellules eucaryotes. Cependant, il ya plusieurs considérations à effectuer avec succès les expériences. D'abord, les souches microbiennes à être utilisés dans une étude.
Il est essentiel dans la comparaison des deux souches à la fois le test de survie, ainsi que par une analyse par microscopie qu'ils sont à des phases de croissance et d'atteindre des concentrations similaires de cellules analogues à celles des différences dans la ci-dessus peuvent influer sur l'efficacité invasion 13. Lorsque les courbes de croissance diffèrent entre les deux souches bactériennes, des ajustements devraient être faits pour atteindre finalement les patrons de croissance similaires partageant concentrations cohérentes 21. En outre, les bactéries doivent être réparties de façon égale pour éviter l'agrégation cellulaire. En outre, il est essentiel de sélectionner des antibiotiques qui éliminent efficacement les bactéries extracellulaires. Si antibiotique choisi a des effets délétères sur les cellules hôtes, puisun enzymes lytiques ou d'autres antibiotiques peuvent être utilisées 24,25. Enfin, la souche hétérogénéité doit être considérée; même si une espèce peut être identifié à envahir les cellules hôtes, il peut y avoir une différence majeure dans la pathogénicité d'une souche à l'autre 26 et donc une étude pilote doit être effectuée pour chaque souche à être examinée.
Une deuxième étape critique est d'établir un temps d'incubation optimal et inoculum bactérien (multiplicité d'infection [MOI], qui est le nombre de bactéries utilisées pour infecter la cellule hôte) lors de la conception des protocoles. Périodes d'incubation plus courte évalueront la capacité des bactéries à être internalisée par des cellules hôtes alors que les points de temps plus longues peuvent être nécessaires pour déterminer la survie des bactéries ainsi que la réplication intracellulaire 27. Comme la survie intracellulaire de bactéries pourrait être affectée par la MOI utilisé, il est préférable de tester multiples IAM pour assurer qu'aucun dommage à la cellule a été causée qui conduirait à la mort cellulaire ou permeabilized membranes avec accès à l'assassinat des antibiotiques des bactéries intracellulaires. Après avoir établi MOI et d'incubation de fois nécessaires pour répondre à la question spécifique qu'on lui demande, l'expérience est géré selon le protocole; cependant, plusieurs dilutions en série du mélange de lyse cellulaire eucaryote bactéries doivent être effectuées. Le facteur de dilution optimale sera déterminée sur la base UFC observés. Les facteurs de dilution qui se traduisent par des plaques avec 50-200 UFC sont optimales pour évaluer l'efficacité de la survie. Si le nombre UFC est trop élevé, les colonies sont indiscernables les uns des autres et il devient difficile de compter manuellement chaque colonie. Si le nombre de CFU est trop faible, de petits écarts exagèrent le facteur de variation entre les souches en cours d'examen ainsi que de produire de grands écarts-types entre les répliques.
Un troisième point critique est de préparer des cellules hôtes qui sont en bonne santé et prêt à interagir avec les bactéries. Dans le protocole ci-dessus des cellules hôtes sont cultivées séparément en utilisant tec aseptique normehniques. L'utilisation d'antibiotiques et antifongiques dans la culture de tissus peut être souhaitable, en particulier pour les débutants biologistes de culture cellulaire. Toutefois, avant d'effectuer le test de survie, les cellules hôtes doivent être cultivées dans des milieux sans antibiotiques pendant au moins 12 h avant le transfert des cellules dans la chambre anaérobie. Une fois à l'intérieur de la chambre, les médias devraient être échangées avec les médias sans antibiotiques anaérobie pour ne pas empiéter sur les bactéries anaérobies cours de l'infection. Si des problèmes existent avec l'attachement de cellules hôtes dans des plaques de culture de tissus ou lamelles couvre-objet en plastique, il peut être souhaitable d'appliquer un revêtement adhésif tel que le poly-L-lysine ou de la gélatine. En outre, les techniques de boîtes de culture de tissus de revêtement avec un sous-sol matrice extracellulaire de type membrane produite naturellement (ECM) peuvent fournir à l'investigateur avec plus in vivo comme conditions 28,29. De lyse des cellules hôtes équilibrée exige un détergent capable de cellules hôtes d'ouverture sans altérer la viabilité bactérienne. Bien que la saponine sera pas kbactéries malades, il peut inhiber la croissance de certaines espèces. Avant nos études, l'effet de saponine sur P. gingivalis souches à utiliser pour l'analyse hôte-pathogène a été vérifié qu'il n'a aucun effet sur la croissance / survie. Si les bactéries sont très sensibles aux détergents, y compris la saponine, cycles gel-dégel répétés de l'eau distillée ou peuvent être utilisées pour lyser les cellules hôtes avec peu de dommages aux bactéries.
Un quatrième point critique comprend les considérations à prendre lors de l'exécution des expériences de microscopie. La première est l'utilisation d'un colorant fluorescent pour marquer les bactéries à utiliser pour le protocole de microscopie. Beaucoup de méthodes actuelles d'étiquetage pour les bactéries exigent un anticorps primaire ou colorants bactériennes coutumières ayant des limitations importantes, telles que les effets toxiques et la lixiviation du colorant dans un environnement donnant ainsi bruit de fond élevé. BCECF-AM est un colorant de membrane perméable utilisée en tant qu'indicateur de pH fluorescent intracellulaire à la fois procaryotes et eucaryotes 30-32. Il a été trouvé pour être efficace à l'identification d'une gamme de bactéries anaérobies dans des études précédentes 33-35. BCECF-AM ne étiqueter bactéries viables capables d'estérification. La conversion à BCECF par des esterases intracellulaires résultats sous une forme fluorescente qui fuit hors des cellules beaucoup plus lentement que son composé parent. Il existe de nombreux colorants fluorescents et des techniques de coloration qui peuvent être utilisés 36; cependant, ce protocole décrit une technique simple de fixation / de coloration qui peut être utilisé avec la plupart des micro-organismes. En outre, d'autres colorants (TRITC-phalloïdine et DAPI) sont utilisés pour distinguer plus clairement les limites des cellules eucaryotes et compte pour seulement bactéries qui interagissent avec les cellules hôtes.
Les colorants fluorescents sont sensibles à la photo-blanchiment et il ya plusieurs antifades commerciales et de montage des supports disponibles qui peuvent empêcher l'affaiblissement du signal fluorescent 37. Il ya aussi des choix difficiles entre jeu montage médias unend ceux douce-set. Tandis que les disques-set peuvent entraîner des changements importants dans l'indice de réfraction ainsi que le retrait et des dommages aux tissus mous 38 les médias d'établissement exigent des produits d'étanchéité, tels que les vernis à ongles, pour garantir la lamelle. Ensuite, en raison de variations observées parmi les cellules eucaryotes infectées; le nombre de bactéries internalisées peuvent varier entre les cellules et les cellules eucaryotes ainsi de multiples doit être utilisé pour l'analyse. Dans nos études, au moins quarante cellules eucaryotes sont évalués et internalisés bactéries énumérés par expérience 33,34. Enfin, pour visualiser clairement des cellules individuelles, des cellules eucaryotes utilisés pour l'infection ne devraient pas être cultivées à confluence. Les examens microscopiques d'infection de Prevotella intermedia avec les cellules épithéliales ont montré préférence pour des régions spécifiques de la membrane de la cellule hôte, et les bactéries ne seraient pas adhérer à des sites où les cellules épithéliales étaient en contact avec l'autre et eu aucune lamellipodes 39.
Le limitation de la microscopie pourrait être son faible débit. Ainsi, pour les données quantitatives à grande échelle sur la propriété invasive de bactéries une cytométrie en flux peut également être utilisé 40. Ce procédé implique l'utilisation de bactéries marquées par fluorescence (qui peut être accompli de la manière décrite pour les bactéries à utiliser pour la microscopie) et permet d'étudier plusieurs échantillons à la fois qui peut être attrayante pour certains chercheurs.
Les modifications apportées aux deux protocoles peuvent être faits pour identifier les voies impliquées dans l'hôte absorption cellulaire des bactéries. Invasion bactérienne réussie se produit en cinq étapes: (1) l'attachement (2) d'entrée / internalisation (3) traite (4) la persistance et (5) la sortie 41. Ainsi lors de l'entrée / internalisation, la bactérie se localise sur l'hôte et usurpe la cellule hôte pour l'internalisation en modifiant la transduction du signal. Inhibiteurs métaboliques sélectifs peuvent être ajoutés à des cellules hôtes afin de déterminer les changements dans la signalisation conduisant à invasion réussie. Pourlatrunculine exemple, qui inhibe la polymérisation de l'actine, peuvent être utilisés pour étudier comment réarrangement du cytosquelette affecte internalisation de P. gingivalis. Les anticorps qui ciblent des récepteurs ou des ARNsi capables de faire tomber certains gènes spécifiques des cellules peuvent également être utilisés pour une meilleure compréhension de la cellule hôte événements impliqués dans l'internalisation de signalisation bactérienne. Alors que tous les inhibiteurs métaboliques devraient avoir un effet minimal sur l'ensemble des cellules hôtes, à l'exception d'une objet d'une enquête, il est important d'assurer les traitements inhibiteurs ne pas avoir un effet toxique sur les bactéries.
Les études futures devraient chercher à perfectionner certaines de ces techniques, atteindre un plus in vivo comme état éventuellement. Dans l'article actuel, des bactéries ou des cellules hôtes sont exposées à des environnements difficiles. En fonction de l'organisme, la lignée cellulaire, et but de l'expérience certains chercheurs peuvent préférer effectuer le protocole ci-dessus dans un incubateur à CO 2. Cependant, lésion parodontales reflètent un microenvironnement anaérobie dans laquelle les bactéries interagissent avec l'hôte. Une étude qui a examiné les variations de la réponse cellulaire à défi avec les bactéries orales sous aérobie par rapport conditions anaérobies rapporté que sous tension réduite d'oxygène (2% d'oxygène) des bactéries, par exemple, Tannerella forsythia, P. gingivalis, et P. intermedia a suscité des niveaux plus élevés d'IL-8 et TNF par rapport à 42 des conditions aérobies. La capacité des cellules eucaryotes à survivre dans des conditions anaérobies a également été confirmé par des études qui ont examiné la capacité des cellules humaines souches mésenchymateuses, les cellules souches du follicule dentaire humaines, des fibroblastes gingivaux humains, des cellules de carcinome de la gencive et des cellules epitheliales buccales humaines 43,44,45. Nos études utilisant WST-1 essai de prolifération de cellules HUVEC ont montré que peut survivre jusqu'à 48 heures dans des conditions anoxiques. La décision a été prise pour infecter les cellules dans la chambre anaérobie parce P. gingivalis est sensible à aules niveaux d'oxygène, tandis HUVECs mospheric peuvent survivre de longues périodes dans des conditions anaérobies. Les recherches futures devront enquêter sur la mise en œuvre de dispositifs de culture cellulaire des micro-fluidique qui fournissent de l'oxygène à une surface d'une monocouche (comme une artère) et des conditions anaérobies à la 46 autres. De cette façon, les conditions ne seront pas sacrifiés pour des bactéries ou hôte lors de l'infection. En résumé, décrit sont quelques protocoles simples qui peuvent être utilisés pour examiner l'interaction hôte-pathogène pour les bactéries anaérobies. Ces protocoles ont également été utilisés pour évaluer l'effet de internalines bactériens, des protéines favorisant l'invasion bactérienne 40, ainsi que les bactéries non invasives de substitution exprimant une protéine conférant une propriété invasive sur les bactéries 47.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vinyl Anaerobic Chamber-Type B | Coy Laboratory Products | Model 2000 incubator | |
| TSA II Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood | BBL | 221261 | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells 10-donor Pool | LifeLine Technology | FC-0044 | |
| VascuLife VEGF Medium Complete Kit | LifeLine Technology | LL-0003 | |
| TrypKit | LifeLine | LL-0013 | |
| Saponin | Riedel-de Haen | 16109 | |
| Gentamicin Sulfate Salt | Sigma-Aldrich | G-1264 | |
| Metronidazole | Sigma-Aldrich | M-3761 | |
| BCECF-AM | LifeTechnologies | B1150 | |
| TRITC Phalloidin | Sigma-Aldrich | P1951 | |
| 18 mm Circular Coverslips | Electron Microscopy Sciences | 72222-01 | |
| VectaShield Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 |
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