Porphyromonas gingivalis som model organisme for vurdering Interaktion af anaerobe bakterier med værtsceller

Abstract

Anaerobe bakterier langt overtal aerober i mange menneskelige nicher såsom tarmen, mund og vagina. Desuden anaerobe infektioner er almindelige og ofte af indfødte oprindelse. Evnen af ​​nogle anaerobe patogener at invadere humane celler giver dem tilpasningsforanstaltninger at undslippe medfødte immunitet samt modulerer værtscelle adfærd. Men sikre, at de anaerobe bakterier er levende under eksperimentel undersøgelse af begivenhederne kan udgøre udfordringer. Porphyromonas gingivalis, en gramnegativ anaerobe, er i stand til at invadere en række eukaryote ikke-fagocytiske celler. Denne artikel beskriver, hvordan du med succes kultur og vurdere muligheden for P. gingivalis at invadere human navleveneendotelceller (HUVEC'er). To protokoller blev udviklet: en til at måle bakterier, der med succes kan invadere og overlever i værten, og den anden til at visualisere bakterier interagerer med værtsceller. Disse teknikker kræver anvendelse af et anaeRobic kammer til at levere P. gingivalis med et anaerobt miljø for optimal vækst.

Den første protokol er baseret på antibiotikummet beskyttelse assay, der anvendes i vid udstrækning til at undersøge invasion af værtsceller af bakterier. Men antibiotikummet beskyttelse analysen er begrænset; kun intracellulære bakterier, der er dyrkbar efter antibiotisk behandling og vært cellelysis måles. For at vurdere alle bakterier interagerer med værtsceller, både levende og døde, udviklede vi en protokol, der bruger fluorescerende mikroskopi til at undersøge vært-patogen interaktion. Bakterier er fluorescensmærket med 2 ', 7'-bis- (2-carboxyethyl) -5- (and-6) -carboxyfluorescein acetoxymethylester (BCECF-AM) og anvendt til at inficere eukaryote celler under anaerobe forhold. Efter fastgørelse med paraformaldehyd og permeabilisering med 0,2% Triton X-100, værtsceller mærket med TRITC phalloidin og DAPI at mærke cellecytoskelettet og kerne, henholdsvis. Multiple imaGES taget på forskellige fokuspunkter (Z-stack) er opnået for tidsmæssige-rumlig visualisering af bakterier. Metoder anvendt i denne undersøgelse kan anvendes på enhver dyrkbare anaerobe og enhver eukaryot celletype.

Introduction

Anaerobe bakterier koloniserer næsten alle overflader af det menneskelige legeme. Selvom fremherskende i floraen i tarmen og urogenitale skrifter, hvor iltkoncentrationen er lav, de eksisterer også ved høje niveauer på huden mund næse, hals den, ^og 1. Anaerobe bakterier er en almindelig årsag til infektioner endogene og ofte isoleret fra syge steder. Men på grund af deres kræsne karakter, kan anaerobe bakterier være vanskeligt at isolere og kultur. Undersøgelser med anaerobe bakterier skal ske på særlige betingelser. Moderne anaerob-kultur teknikker gør det muligt for forskerne at efterligne de anaerobe indstillinger, der kræves for at studere mange anaerobe laboratoriestammer eller endda kliniske isolater ^2,3.

Sygdomsfremkaldende anaerobe bakterier har udviklet et dynamisk forhold og co-evolution med værten celler, hvor de bor. De fleste anaerobe er modtagelige for drab med værtens immunrespons, før de når infectiskellige niveauer. Imidlertid har nogle sygdomsfremkaldende bakterier udviklet mekanismer til at flygte fra eller undergrave værtens immunrespons. De opnå dette mål gennem mekanismer såsom unddragelse af immun anerkendelse, neutralisering af immune mediatorer, ændring af cellemedieret immunitet, invasion af værtsceller, og ændring af immun signalering ^4. Porphyromonas gingivalis, en gramnegative anaerobe impliceret i både mundtlig og ekstraorale sygdomme, er et eksempel på en meget tilpasset bakterielt patogen stand til at forårsage patogene ændringer i værten ^5-7.

Lommer af biofilm plak påløbne i dybe sprækker dannet mellem tænderne og gingival slimhinde væv kan harbor anaerobe bakterier, der er beskyttet af atmosfærisk ilt ^8. Disse tandkødslommer tjene som en niche for forskellige anaerobe patogener, såsom P. gingivalis ^9. P. gingivalis er en hjørnesten patogen, der er i stand til remodeling af den mundtlige mikrobielle samfund på måder, der fremmer udvikling og progression af parodontale sygdomme ^10. Det producerer en lang række virulensfaktorer som er aktive mod et bredt spektrum af værtsproteiner og indeholder mekanismer til omgåelse af værtsforsvar ^11. Det er også i stand til at invadere epitel-, endotel- fibroblastisk, og parodontale ligament celler in vitro ^12-14 og in vivo ^15. Ved effektivt invaderer værtsceller, P. gingivalis kan undslippe vært immunitet. Effektiv invasion af værtsceller ikke kun tillader bakterien at undslippe værtsforsvar men fungerer også som et reservoir for fremtidig reinfektion samt ændrer værtscellen. Undersøgelser af de molekylære mekanismer, der er involveret i adhæsion og internalisering af bakterie ved værtsceller er nødvendige. Forskning i flere laboratorier er fokuseret på at forstå de molekylære begivenheder, der er forbundet med internalisering af P. gingivalis ved værtcellernesamt de mekanismer, der anvendes til at undertrykke og kapre immunresponset og overleve de fjendtlige værtsforsvarsmekanismer.

Der er mange assays er i stand til at identificere og karakterisere patogener, der er i stand til at invadere værtsceller. Men in vitro-undersøgelser med anaerobe patogener udgør mange eksperimentelle problemer for forskeren hovedsagelig fordi det er vanskeligt at foretage undersøgelser, der er afhængige af voluminøse instrumenter i fravær af ilt. Dette forstærkes af det faktum, at eukaryote celler kræver ilt for at vokse og dermed skal være forberedt separat i vævskultur væksthuse. En måde at undgå sådanne hindringer ville være at udføre undersøgelserne under atmosfærisk ilt, men det ville gøre væksten af ​​anaerobe bakterier umulig. En anden metode ville være at anvende varmedræbte bakterier til at inficere og studere vært-celle-interaktioner. Men der er forskelle mellem varme-dræbt og levedygtige bakterier, der mindsker relevansen af ​​vært-patogen interacti^den 16.. Det er centralt at studere levedygtige bakterier med uændret udtryk interagerer med værtsceller; derfor, metoder til dyrkning af P. gingivalis i en anaerob indstilling er angivet. Desuden er to simple omkostningseffektive protokoller demonstreret for at vurdere evnen af P. gingivalis skal internaliseres af humane navleveneendotelceller (HUVEC'er). Den første protokol er baseret på den populære antibiotikum beskyttelse assay. Selvom assayet er ligetil, er overvejelser ved brug anaerobe mikroorganismer givet. Den anden protokol kræver brug af et fluorescerende scanning mikroskop for at visualisere interagere og internaliseret P. gingivalis. Hvert assay har sine begrænsninger og fordele, som vil blive diskuteret for at give forskeren en skitse til at studere invasiv anaerobe bakterier. Selv om den nuværende manuskript studerer P. gingivalis og HUVEC'er, kan disse protokoller anvendes til mange andre anaerobe bakterier samtsom for andre typer af værtsceller.

Protocol

Følgende protokoller beskriver fremgangsmåder til dyrkning og studere invasionen af anaerobe arter, P. gingivalis; Dog kan disse protokoller anvendes til en række anaerobe patogener. Selv HUVEC'er anvendes, kan denne protokol anvendes til andre eukaryote celler både immune og ikke-immune.

1. Anaerob Chamber brug og vedligeholdelse

Bemærk: P. gingivalis er en anaerob følsom over normale niveauer af ilt stødt i luften. En kontrolleret anaerobt miljø er afgørende for dyrkning af P. gingivalis.

1. Her opretholde en kunstig atmosfære udpeget som blandede anaerobe gas (80% _N2, 10% _H2, 10% CO ₂₎ i en vinyl anaerobt kammer (figur 1A). Brug en luftsluse (figur 1B) til overførsel af elementer fra laboratoriemiljøet til den anaerobe kammer. Luftslusen driver manuelt, twice rensning med _N2-gas, før der indføres den blandede anaerobe gas.
2. Brug en hydrogensulfidfjernelse søjle (figur 1C) for vedligeholdelsesfri fjernelse af uønskede hydrogensulfid. Placer en affugter i kammeret for at fjerne _H2O skabt af katalysatoren og for at undgå aerosoler, der letter spredning af kontaminering.
   Bemærk: Hydrogensulfid er en naturlig metabolisk biprodukt af mange anaerobe bakterier og ophobning er giftigt for bakterier og kan resultere i skader på elektronik og mindske levetiden af ​​en katalysator.
3. Brug en ventilator til at cirkulere boks kammerets atmosfære gennem en palladiumkatalysator, som fjerner oxygen i nærvær af hydrogen (figur 1D).
   Bemærk: En recirkulerende atmosfæriske (HEPA) filter fjerner luftbårne urenheder med en størrelse på 0,22 um eller større.
4. Kultur anaerobe bakterier i en 37 ° C inkubator, der er placeret inde i den anaerobekammer. Brug standard aseptisk teknik, når du arbejder inde i anaerobe kammer.

Figur 1. Anaerob vinyl kammer og dets komponenter. (A) En vinyl anaerob kammer forseglet fuldstændigt fra atmosfærisk ilt giver arbejdsområde for to personer ad gangen (32 cm x 78 in). Den indeholder en inkubator indstillet til 37 ° C (igen i midten). (B) en luftsluse anvendes til overførsel af varer fra laboratoriet miljøet for anaerobt kammer. Billedet er en automatisk luftsluse drives gennem en controller, der kan programmeres til automatisk at udføre vakuum og purge procedurer, der er nødvendige for at skabe et anaerobt miljø. (C) En hydrogensulfidfjernelse Kolonne giver vedligeholdelsesfri høj kapacitet fjernelse af uønsket hydrogensulfid. (D) To katalysator fan bokse erplaceret i hele anaerobt kammer for at hjælpe cirkulere kammerets atmosfæren gennem palladiumkatalysator, som i nærvær af hydrogen, fjerner oxygen. Den anaerobe kammer er sat op i henhold til producentens anvisninger. Klik her for at se en større version af dette tal.

2. Fremstilling af anaerobe bakterier

Bemærk: P. gingivalis er aerotolerant og kan opbevares i aerobe betingelser, men det vil ikke vokse i nærværelse af oxygen på niveauer højere end 6% ^17,18. En anaerob kammer er nødvendigt for en korrekt dyrkning af P. gingivalis og andre anaerobe arter (figur 1). Ordentlig uddannelse og undervisning på anaerob brug kammer er påkrævet, før du arbejder med microanaerobes ^19.

1. Ækvilibrer alle flydende medier og plader til anaerob conditioner i mindst 12 timer forud for eksperimenter for at fjerne resterende oxygen.
2. Overfør P. gingivalis fra -80 ° C fryser anaerob kammer, lad tø.
3. Streak P. gingivalis på trypticase blodagarplader (TSA II med 5% fåreblod). Wrap plader i parafilm og opbevares ved 37 ° C i en anaerob inkubator i 4-7 dage.
4. Pode P. gingivalis i 3 ml hjerne-hjerte-infusion (BHI) bouillon suppleret med hemin og menadion, et beriget ikke-selektive flydende medier til isolering og dyrkning af anaerobe og kræsne mikroorganismer, anvendelse af sterile loops.
   Bemærk: Ved langtidsopbevaring, bland bakteriekulturer udarbejdet i BHI med glycerol eller DMSO (10-20% slutkoncentration) og sted i en -80 ° C fryser.
5. Forbered en starterkultur af P. gingivalis ved at gøre en 1:10 fortynding og tillade bakterier til at vokse, indtil midten af log-fasen.

Bemærk: Den optiske densitet af indholdet i blodetteriale suspension bestemmes, og bakteriel koncentration for hver stamme, der skal undersøges justeres. For P. gingivalis en suspension ved OD ₆₆₀ på 0,7 svarer til midten af logaritmisk fase og ~ 7 x 10 ⁸ celler / ml. Vækstbetingelser beskrevet i protokollen ovenfor er specifikke for P. gingivalis og skal muligvis tilpasses til andre bakteriestammer.

3. endothelial Cellekultur

Bemærk: Purchase poolet primære HUVEC'er og kultur i basalt medium indeholdende vaskulær endotel vækstfaktorer (VEGF) ved 37 ° C i _5% CO2 i henhold til producentens anvisninger.

1. Seed HUVEC'er i T-75 kolber på 2,5 x 10 ⁵ celler / kolbe i 15 ml VEGF medier.
   Bemærk: Kontroller levedygtighed via en 1: 1 fortynding med 4,0% trypanblå. Celler med en kompromitteret membran vil bevare trypanblå vil raske celler med intakte membraner ser hvid, når den ses under et binokulært lysmikroskop. Count 100 celler, at over 80% af cellerne er levedygtige ^20.
2. Udskift medier hver 2. dag med forvarmet frisk VEGF medier, indtil cellerne når ~ 80% konfluens.
3. Vask cellerne en gang med forvarmet PBS. Frigøre celler fra T75 kolbe ved inkubering med 2 ml trypsin-EDTA (0,25%) i 5 minutter efterfulgt af 2 ml trypsin neutraliserende opløsning.
4. Saml suspenderede HUVEC'er i en 50 ml konisk rør. Udvaske eventuelle ekstra celler fra T-75 kolber med PBS og overføres til 50 ml koniske rør.
5. Centrifuger cellerne ved 200 x g i 10 min.
6. Fjern supernatanten, suspendere cellepelleten i 10 ml forvarmet VEGF medier.
7. Bestem cellekoncentration anvendelse af et hæmocytometer eller lignende celletælling enhed.
8. Beregn mængden af ​​cellesuspension for at tilføje til enten 6-brønds plade (400.000 / brønd) eller 12-brønds plade med dækglas (50.000 / brønd). HUVEC'er vil være klar til eksperimenter næste dag.

4. Overlevelse Assay Invasion / Interaktion(Plating)

Bemærk: Ved udførelse af dette assay udarbejde to 6-brønds plader af endotelceller podet ved 400.000 celler / brønd. Én plade vil blive anvendt til at vurdere bakterier fastgjort til og er internaliseret gennem værtsceller. Den anden plade vil tegne sig for intracellulære bakterier. 6-brønds plade giver mulighed for tredobbelte af to prøver, der skal udføres i et eksperiment. For en oversigt over denne protokol henvises til overlevelse assay flowchart (figur 2).

1. Forbered anaerobe bakterier som beskrevet ovenfor (se afsnit 1), indtil de når vækst midt-log (OD ₆₆₀ 0,5-0,7).
2. Centrifuger bakterier på 5.000 xg i 10 min.
   Bemærk: Hvis centrifugen er uden anaerob kammer, bære bakterielle prøver i en tæt forseglet 15 ml rør, wrap hætten med parafilm at forhindre ilt lækage.
3. Placer pelleteret P. gingivalis tilbage i kammeret, kasseres supernatanten. Vask med PBS, pellet bakterier igen, før opblandes i VEGF migdia. Forbered suspensioner til alle bakteriestammer, der skal testes ved OD ₆₆₀ på 0,7, som svarer til midten af log-fase (~ 7 x 10 ⁸ celler / ml). Bakterierne er nu klar til infektion.
4. Overfør 6-brønds plader indeholdende HUVEC'er fra vævskultur inkubator i anaerobt kammer. Fjern mediet og vask tre gange med anaerob PBS. Tilsæt 2 ml anaerob VEGF medier til hver brønd, og anbring pladerne ved 37 ° C i den anaerobe inkubator i 20 minutter for at ækvilibrere temperaturen for infektion.
   Bemærk: Plate bakterier på blodagarplader at sikre dem, der anvendes til infektion er homogene og ikke forurenet efter infektion.
5. Inficere værtsceller med bakterier ved en infektionsmultiplicitet (MOI bakterier: host) på 100: 1.
   Bemærk: HUVEC celleantallet bestemmes ved at udføre en trypan udelukkelse test på en enkelt brønd før infektion. Bakteriel celletal bestemmes via optisk densitet (f.eks OD på 0,5 = 5 x 10 ⁸ celler / ml). Bacterial koncentration justeres til korrekt MOI baseret på HUVEC'er koncentration ^21.
6. Placer 6-brønds plader med inficerede HUVEC'er i anaerob inkubator og tillade bakterier at interagere med værtsceller til 30 min.
7. Forbered saponin i BHI (1,0% w / v) inde i anaerobt kammer og filtreres gennem et 0,2 um filter.
8. Overlevelse af begge er bundet og internaliserede bakterier.
   1. Fjern pladerne fra inkubatoren, Aspirer medier, vaskes tre gange med anaerob PBS og tilsæt 2 ml filtreret 1,0% saponin (fremstillet som beskrevet i trin 4.8). Inkuber i 15 minutter for at tillade værten cellelyse.
   2. Skrabe bunden af ​​hver brønd med celleskraber. Saml celleblandingen fra hver brønd og gøre en 1: 1 fortynding i BHI.
   3. Fortsætte med at foretage serielle fortyndinger af prøven. Afhængig af bakteriearter og koncentration, justere seriefortyndinger. Start med 1: 100 eller 1: 1.000 fortyndinger.
   4. Plate 200 pi ønskede fortynding på blodagarplader. Wrap than plader i parafilm og plads i den anaerobe inkubator ved 37 ° C.
   5. Efter syv dages inkubation ved 37 ° C, fjernes pladerne og tælle kolonidannende enheder (CFU'er) ved hjælp af en lyskasse manuelt at tælle kolonier.
      Bemærk: CFUer optælles. Ved større mængder CFUer, kan billederne tages og edb software kan bruges til at lette optælling af CFUer.
9. Overlevelse af internaliserede bakterier.
   1. Fjern pladerne fra inkubatoren. Der vaskes tre gange med PBS og anaerob tilsættes 2 ml VEGF medier med suppleret antibiotikum (300 ug / ml gentamicin og 400 ug / ml metronidazol).
   2. Der inkuberes i 1 time. Vær sikker på at teste de antibiotika, så de er 100% effektiv til at dræbe den ønskede bakteriestamme, og sørg for, at de ikke trænge værtsceller ^22,23.
   3. Aspirer medier, tilsættes 2 ml filtreret 1,0% saponin. Inkuber i 15 minutter for at tillade værten cellelyse.
   4. Skrab bunden af ​​hver welll med celleskraber. Saml celleblandingen fra hver brønd og foretage 1: 1 fortynding i BHI.
   5. Forbered seriefortyndinger af prøven (1: 100, 1: 1000).
   6. Plate 200 pi ønskede fortynding på blodagarplader. Wrap plader i parafilm og plads i anaerobe inkubator.
   7. Efter syv dages inkubation ved 37 ° C fjernes pladerne og tælle CFU'er.

Figur 2. Skematisk fremstilling af en protokol, der bruges til overlevelse anaerobe bakterier med eukaryote celler. Begge analyser for en samlet bakteriel overlevelse og overlevelse af internaliserede bakterier kan udføres på samme tid. Klik her for at se en større version af dette tal.

5. Internalisering Bacteria i Host CeLLS (Fluorescent Microscopy)

Bemærk: P. gingivalis er mærket med 2 ', 7'-bis- (2-carboxyethyl) -5- (and-6) -carboxyfluorescein, acetoxymethylester (BCECF-AM). BCECF-AM er en ikke-fluorescerende membran-permeabel farvestof; dets omdannelse til fluorescein BCECF via virkningen af intracellulære esteraser kan indikere cellelevedygtighed. P. gingivalis er mærket med BCECF-AM farvestof og derefter anvendt til at inficere eukaryote celler. Efter infektion fikseres cellerne og mærkes med DAPI og TRITC-phalloidin. Den DAPI plet bruges til at farve den eukaryote cellekernen vil også mærke bakteriel cellekernen, som giver en mod-foranstaltning for at identificere ikke-levedygtige bakterier, der kan ikke metabolisk spalter BCECF-AM. Værtsceller er fremhævet med TRITC-phalloidin, en rød actin farvestof.

1. Autoklave dækglas. Tilsættes aseptisk dækglas til 12-brønds plader før podning endotelceller med 5 x 10 ⁴ celler / brønd. (Fremstillet dagen før eksperimentet)
2. Forbered anaerobe bakterier dyrket til midt-log-fase (OD ₆₆₀ = 0,5-0,7) som beskrevet i afsnit 1.
3. Vask bakterier 2x med anaerob PBS ved centrifugering ved 5000 x g og suspension pellet i PBS ved 5-7 x 10 ⁸ celler / ml.
4. Tilsæt 20 pi 0,2 mM BCECF-AM til 2 ml bakteriesuspension (5-7 x 10 ⁸ celler / ml) til en slutkoncentration på BCECF-AM på 2 uM.
5. Der inkuberes ved 37 ° C i 30 minutter i mørke.
6. Overførselsplader med endothelceller podet på 18 mm (# 1.5) tykkelse cirkulære dækglas fra vævskulturinkubator i anaerobt kammer. Vask med PBS og udveksling med anaerob VEGF medier.
   Bemærk: Kontroller, at HUVEC'er er sunde under et lysmikroskop. HUVECS bør være ~ 80% sammenflydende, bør morfologi være sammenlignelig med producenterne.
7. Centrifuger mærkede bakterier på5.000 x g i 10 min for at fjerne resterende BCECF-AM farvestof. Suspendere 2 ml anaerob VEGF medier.
8. Inficere værtsceller med mærkede bakterier ved MOI på 100: 1 (bakterier: host).
9. Inkuber i anaerobt kammer ved 37 ° C i 30 minutter.
10. Efter infektion Vask cellerne med PBS tre gange, og fastgør frisk fremstillet 4,0% paraformaldehyd i 10 min.
    Bemærk: Efter fastsættelse celler, kan forsøget udføres uden for det anaerobe kammer.
11. Vask dækglas med PBS tre gange.
12. Der tilsættes 1 ml 0,2% Triton X-100 i 10 min.
13. Vask dækglas med PBS tre gange.
14. Der tilsættes 50 pi TRITC phalloidin (50 ug / ml) til dækglas i 45 minutter.
15. Vask Dækglas tre gange, fjerne fra 12 brønde og sted på et dias med soft-sæt montering medium, der indeholder DAPI. Forsegl siderne med neglelak.
    Bemærk: Slides kan opbevares et par måneder i mørke. Undgå lyseksponering for at forhindre fotoblegning.
16. Se diasanvendelse af et konfokalt mikroskop.
    1. Her skal du bruge en 34-kanal spektral-system (32-kanals-array detektor og to side PMT detektorer, plus en transmitteret lys detektor) konfigureret omkring en AxioObserver (inverteret) stå med en motoriseret XY scene. Systemet har fem lasere: blå diode (405 nm), multi-line Argon (458, 488, 514 nm), grøn diode (561 nm), rød HeNe (633 nm) og en 440 nm pulseret laser. Udstyre en fluorescenslevetid Imaging-system med 2 hybrid Gaasp detektorer (for FRET-FLIM).
    2. Detect fluorescens fra DAPI og TRITC i en kanal ved hjælp af en dual-band filter med excitationsbølgelængder af 340-380 nm og 540-560 nm og en emission filter 435-485 nm og 570-590 nm hhv. Detektere fluorescens fra BCECF-AM anvendelse af et filter med excitationsbølgelængde på 440 til 500 nm og en emission filter 510-590 nm.
       Bemærk: Kontroller for BCECF-AM bør ske på hver bakteriestamme blive undersøgt for at sikre korrekt mærkning af levedygtige bakterier. Først validere, at nonviable bakterier er DAPI-positiv og BCECF-negative. For det andet, at levende bakterier kan metabolisere BCECF-AM i fluorescein BCECF. Kan være nødvendigt at blive testet for optimal mærkning variable koncentrationer af bakterier eller BCECF-AM farvestof.

Representative Results

Protokoller skitseret ovenfor blev anvendt til at studere værtspatogene interaktion mellem P. gingivalis og endotelceller. P. gingivalis W83 og en P. gingivalis V3150 bærer en deletion af PG0228 blev anvendt i undersøgelsen. Den PG0228 forudsiges at kode for et protein, som kan ændre niveauet af RNA og proteiner, som i sidste ende kan påvirke interaktion af P. gingivalis med værtsceller. For at undersøge effekten af PG0228 på P. gingivalis 's evne til at interagere med værtsceller, blev evnen af de parentale og mutantstammer at interagere med HUVEC'er forhold. Overlevelsen protokollen (figur 2) blev påført på denne undersøgelse. Således blev begge stammer dyrket til logaritmisk fase som beskrevet i trin 2. Begge stammer havde lignende vækstkurver og dermed ingen væsentlige problemer med normalisering af celleantal før infektion blev stødt. Efter syv dages inkubation blev observeret på CFU'er blodet agar plader (figur 3). Adskillige fortyndinger 1:10 (figur 3A), 1: 100 (figur 3C) og 1: 1000 (Figur 3B) blev udpladet på blodagarplader. Som det ses i figur 3A antallet af kolonier var for høj til at vurdere; kolonierne var umærkelig fra hinanden og betegnes som "for mange til at tælle" [TMTC]. Fortyndingen i figur 3B var for lav som for få kolonier opnås. De fortyndinger på 1: 100 som vist i figur 3C var ønskelig, da kolonierne er mærkbare, og antallet af kolonier var overskueligt at tælle. Lignende resultater blev fundet for mutantstammen V3150 (figur 3D). Således CFU'erne blev optalt fra pladerne med fortyndingsfaktoren på 1: 100.

Ved hjælp af antallet af CFU'er og fortyndingsfaktoren, blev det anslåede antal af levedygtige bakterier inddrevet for hver stamme beregnet. Dividere antallet af viable bakterier inddrives af det oprindelige antal af bakterier resulterer i et forhold defineret som invasionen effektivitet. Ved sammenligning af invasion effektiviteten af begge stammer, vildtype W83 overlevede inden HUVEC'er med høj effektivitet, mens stammer der mangler PG0228 viste en signifikant reduktion i overlevelse (figur 4).

For yderligere at kontrollere, at defekten skyldtes overlevelse snarere end reduceret internalisering af bakterierne, blev mikroskopi analyse udført. HUVEC'er inficeret med P. gingivalis blev betragtet under et mikroskop (figur 5). I dette eksempel er en HUVEC fremlagt. For at bestemme antallet af internaliserede bakterier flere billeder blev taget ved forskellige brændvidder for at opnå en Z-stack giver mulighed for fysisk-temporale identifikation af internaliseret P. gingivalis. Også, mindst 40 celler / forsøget bør analyseres (for hver biologisk replikat) og antallet af internaliserede bakterier optælles for hver mregn. Hvis antallet af internaliserede bakterier er den samme for hver stamme, når de ses under et mikroskop derefter begge stammer invaderer HUVEC'er lige; imidlertid har mutanten V3150 nedsat evne til at overleve, mens i værtscellen som det ses i den antibiotiske beskyttelse assay.

Figur 3. Resultater fra en bakteriel overlevelse assay. Protokol for overlevelse af intracellulære bakterier blev anvendt til at vurdere evnen af vildtype P. gingivalis W83 og en mutant V3150 mangelfuld i PG0228 at invadere og overleve inden HUVEC'er. Internaliserede levedygtige bakterier bestemmes ved visualisering af CFU'er efter inkubation af HUVECs- P. gingivalis blandingen på blod agarplader i syv dage under anaerobe forhold. Blod plader er placeret på lyskasse, der øger kontrasten og gør det lettere at tælling af CFU'erne. Forskellige fortyndinger blev examined. HUVEC'er inficeret med P. gingivalis W83 fortynding på 1:10 (A), fortynding 1: 1000 (B), og fortynding 1: 100 (C). HUVEC'er inficeret med P. gingivalis V3150 fortynding 1:. 100 (D) Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4. Sammenligning af en overlevelsesrater mellem forældrenes og mutant bakteriestammer. HUVEC'er blev inficeret med vildtype P. gingivalis W83 og en mutant V3150 mangelfuld i PG0228. Protokol for overlevelse som skitseret i figur 2 blev fulgt. Eksperiment blev udført tre gange i tre eksemplarer og middelværdien ± standardafvigelser er præsenteret. Invasion effektivitet repræsenterer overlevet / indledende bakterier.* Mutantstammen har statistisk signifikant reduceret overlevelse sammenlignet med vildtype W83 stamme (P <0,05). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5. Eksempel på en mikroskopisk analyse af P. gingivalis internaliseres af HUVEC'er. HUVEC'er blev inficeret med BCECF-AM-mærket P. gingivalis i 30 minutter ved en MOI på 100: 1 (P. gingivalis: HUVEC). Cellerne blev fikseret med paraformaldehyd og mærket med TRITC-phalloidin og DAPI. Billedet viser en enkelt HUVEC med kernen (A) og F-actin (B) farvet blå og røde, henholdsvis. Pilen angiver P. gingivalis mærket grønne (C). En fusionerede image er produceret for at vise P. gingivalis invasion i HUVEC'er (D). Billeder blev fremstillet ved hjælp af scanning konfokal mikroskop. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Alle ovennævnte metoder kan anvendes til at designe specifikke assays til vurdering af interaktionen af ​​anaerobe bakterier med eukaryote celler. Men der er flere overvejelser at kunne udføre forsøgene. Først er de mikrobielle stammer, der skal anvendes i en undersøgelse.

Det er afgørende i sammenligning af to stammer med både overlevelse assay samt ved mikroskopi-analyse, at de er på lignende vækstfaser og nå lignende cellekoncentrationer som eventuelle forskelle i ovenstående kan påvirke invasion effektivitet ^13. Når vækstkurver varierer mellem to bakteriestammer, bør foretages justeringer i sidste ende opnå lignende vækstmønstre deler konsistente koncentrationer ^21. Desuden bør bakterier spredes jævnt for at undgå celleaggregering. Desuden er det vigtigt at vælge antibiotika, der effektivt fjerner ekstracellulære bakterier. Hvis valgte antibiotikum har skadelige virkninger på værtsceller, derefteret andet antibiotikum eller lytiske enzymer kan anvendes ^24,25. Endelig skal stamme heterogenitet overvejes; selv om en art kan identificeres til at invadere værtsceller, kan der være stor forskel i patogenicitet fra en stamme til en anden ²⁶ og dermed en pilotundersøgelse skal udføres for hver stamme, der skal undersøges.

Et andet afgørende skridt er at etablere en optimal inkubationstid og bakteriel inokulum (infektionsmultiplicitet [MOI], som er antallet af bakterier, der anvendes til at inficere værtscellen) ved konstruktionen af ​​protokoller. Kortere inkubationsperioder vil vurdere evnen af bakterier, der skal internaliseres af værtsceller mens længere tidspunkter kan være behov for at bestemme bakteriel overlevelse samt intracellulær replikation ^27. Som intracellulær overlevelse af bakterier kunne blive påvirket af MOI bliver brugt, er det bedst at teste flere MOI for at sikre, at ingen skade til celle blev forårsaget som ville føre til celledød eller permeabilized membraner med adgang til antibiotisk drab af intracellulære bakterier. Efter oprettelse MOI og inkubationstider er nødvendige for at besvare det konkrete spørgsmål bliver spurgt, er eksperimentet køre i henhold til protokollen; imidlertid bør flere serielle fortyndinger af den eukaryote celle lysisblandingen-bakterier foretages. Den optimale fortyndingsfaktor vil blive fastlagt på grundlag af CFUer observerede. Fortyndingsfaktorer, der resulterer i plader med 50-200 CFU'er er optimale til at vurdere overlevelse effektivitet. Hvis Kimtal er for høj, kolonier umærkelig fra hinanden, og det bliver vanskeligt at manuelt at tælle hver koloni. Hvis CFU count er for lav, små afvigelser overdrive folden skift mellem stammer undersøges samt producere store standardafvigelser mellem replikater.

Et tredje kritiske punkt er at forberede værtsceller, som er sunde og klar til at interagere med bakterier. I ovenstående protokol værtsceller dyrkes separat under anvendelse af standard aseptisk techniques. Brugen af ​​antibiotika og antimykotika i væv dyrkning kan være tilrådeligt, især for begyndere cellekultur biologer. Men før udførelse overlevelse assay værtsceller bør dyrkes i antibiotisk-frie medier for mindst 12 timer før overførsel af cellerne i anaerobt kammer. Når du er inde i kammeret, bør medierne udskiftes med anaerobe antibiotika-frie medier for ikke at kollidere med anaerobe bakterier under infektion. Hvis der er problemer med vedhæftning af værtsceller plastisk vævskulturplader eller dækglas kan det være tilrådeligt at anvende en klæbende belægning, såsom poly-L-lysin eller gelatine. Desuden kan teknikker til belægning vævskultur retter med et naturligt produceret basalmembran-lignende ekstracellulære matrix (ECM) forsyne investigator med mere in vivo lignende forhold ^28,29. Lysere værtsceller kræver en afbalanceret rengøringsmiddel stand til at åbne op værtsceller uden at ændre bakteriel levedygtighed. Selv saponin ikke vil ksyge bakterier, kan det hæmme væksten af ​​nogle arter. Forud for vores studier effekten af saponin på P. gingivalis-stammer, der skal anvendes til værtspatogene analyse blev verificeret til at have nogen effekt på deres vækst / overlevelse. Hvis bakterier er yderst følsomme over for detergenter, herunder saponin, kan anvendes gentagne fryse-tø-cykler eller destilleret vand for at lysere værtscellerne med ringe skade på bakterier.

En fjerde kritisk punkt omfatter de overvejelser, der skal tages ved udførelse af mikroskopi eksperimenter. Først er anvendelsen af ​​et fluorescerende farvestof til at mærke bakterier, der skal anvendes til mikroskopi protokollen. Mange nuværende mærkning metoder for bakterier kræver et primært antistof eller sædvanlige bakterielle farvestoffer med betydelige begrænsninger, såsom toksiske virkninger og udvaskning af farvestof i omgivelserne og dermed give høj baggrund. BCECF-AM er et farvestof membran-permeabel almindeligt anvendt som en fluorescensindikator af intracellulær pH i både prokaryote og eukaryote ^30-32. Det viste sig at være effektiv til mærkning af en række anaerobe bakterier i tidligere undersøgelser ^33-35. BCECF-AM vil kun mærke levedygtige bakterier er i stand til esterificering. Omdannelsen til BCECF af intracellulære esteraser resulterer i en fluorescerende form, der siver ud af celler langt langsommere end dens oprindelige forbindelse. Der er mange fluorescerende farvestoffer og farvningsteknikker der kan anvendes ^36; Men denne protokol skitserer en enkel fiksering / farvning teknik, der kan bruges med næsten hvilken som helst mikroorganisme. Desuden anvendes andre farvestoffer (TRITC-phalloidin og DAPI) til mere klart at skelne grænserne for de eukaryote celler og udgør kun bakterier, der interagerer med værtsceller.

Fluorescerende farvestoffer er modtagelige for fotoblegning og der er flere kommercielle antifades og montage medier til rådighed, der kan forhindre svækkelse af det fluorescerende signal ^37. Der er også valg mellem hårde sæt monteringsmedie ennd soft-sæt dem. Mens de hårdt sæt dem kan medføre betydelige ændringer i den ildfaste indeks samt svind og vævsskader ³⁸ de bløde-indstilling medier kræver tætningsmidler, såsom neglelak, for at sikre dækglasset. Så på grund af variationer observeret blandt inficerede eukaryote celler; antallet af internaliserede bakterier mellem celler kan variere, og dermed flere eukaryote celler skal anvendes til analyse. I vores undersøgelser, er mindst fyrre eukaryote celler vurderet og internaliserede bakterier opregnede per eksperiment ^33,34. Endelig er klart visualisere enkelte celler, eukaryote celler anvendt til infektion ikke bør dyrkes til konfluens. Mikroskopiske undersøgelser af Prevotella intermedia infektion med epitelceller viste præference for specifikke regioner i værtscellemembranen, og bakterierne vil ikke klæbe til steder, hvor epitelceller var i kontakt med hinanden og ikke havde lamellipodia ^39.

Lefterligning af mikroskopi kunne være dets lave kapacitet. Således for store kvantitative data om invasive egenskab af bakterier en flowcytometri kan også anvendes ^40. Denne fremgangsmåde indebærer anvendelse af fluorescensmærkede bakterier (der kan opnås som beskrevet for bakterier, der skal anvendes til mikroskopi) og giver mulighed for at studere flere prøver ad gangen, der kan være attraktiv for nogle forskere.

Ændringer i de to protokoller kan gøres for at finde midler, der er involveret i værtscelle optagelse af bakterier. Vellykket bakteriel invasion sker i fem faser: (1) fastgørelse (2) post / internalisering (3) ulovlig handel (4) vedholdenhed og (5) afkørsel ^41. Således under indtastning / internalisering, bakterien lokaliserer sig på værten og usurps værtscellen til internalisering ved at ændre signaltransduktion. Selektive metaboliske inhibitorer kan tilsættes til værtsceller at bestemme ændringer i signalering fører til vellykket invasion. Foreksempel latrunculin, som hæmmer actinpolymerisation, kan anvendes til at undersøge, hvordan cytoskelettet omlejring påvirker internalisering af P. gingivalis. Antistoffer, der er målrettet cellespecifikke receptorer eller siRNA i stand til at vælte visse gener kan også anvendes til en bedre forståelse af værtscelle signalering begivenheder involveret i bakteriel internalisering. Mens alle metaboliske inhibitorer skal have minimal samlede virkning på værtsceller, bortset fra den, der undersøges, er det vigtigt at sikre inhibitor behandlinger ikke har en toksisk virkning på bakterier.

Fremtidige studier vil se at perfektionere nogle af disse teknikker, muligvis opnå en mere in vivo lignende tilstand. I den nuværende artikel, enten bakterier eller værtsceller udsat for barske miljøer. Afhængigt af organismen, cellelinjen, og mål af forsøget nogle forskere kan foretrække at udføre den ovennævnte protokol i en _{CO2-inkubator.} Men periodontal læsions afspejle en anaerob mikromiljø hvor bakterierne interagerer med værten. En undersøgelse, der undersøgte variationer i cellulært respons til at udfordre med orale bakterier under aerobe forhold anaerobe forhold rapporterede, at under reduceret ilt spænding (2% ilt) bakterier, fx Tannerella Forsythia, P. gingivalis og P. intermedia fremkaldte højere niveauer af IL-8 og TNFa sammenlignet med aerobe betingelser ^42. Evne eukaryote celler til at overleve under anaerobe betingelser blev også bekræftet ved forsøg som undersøgte evnen hos humane mesenkymale stamceller, humane dental follicle stamceller, humane gingivale fibroblaster, gingival carcinomaceller, og humane orale epitelceller ^43,44,45. Vores undersøgelser under anvendelse af WST-1-celleproliferation assay viste, at HUVEC'er kan overleve i op til 48 timer under anoxiske betingelser. Det blev besluttet at inficere cellerne i den anaerobe kammer, fordi P. gingivalis er følsom over for påmospheric iltindhold, mens HUVEC'er kan overleve længere tid under anaerobe forhold. Fremtidig forskning vil undersøge gennemførelsen af mikro-strømningstekniske cellekultur enheder, der leverer oxygen til en overflade af et monolag (ligesom en arterie) og anaerobe betingelser i den anden ^46. Denne måde betingelser vil ikke blive ofret til enten bakterier eller vært på infektion. Sammenfattende beskrevet er et par simple protokoller, der kan anvendes til at undersøge værtspatogene interaktion for anaerobe bakterier. Disse protokoller er også blevet anvendt til at vurdere virkningen af bakterielle internalins, proteiner fremmer bakterieangreb ^40, samt surrogat non-invasive bakterier, der udtrykker et protein, der bibringer invasiv ejendom på bakterierne ^47.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vinyl Anaerobic Chamber-Type B	Coy Laboratory Products		Model 2000 incubator
TSA II Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood	BBL	221261
Human Umbilical Vein Endothelial Cells 10-donor Pool	LifeLine Technology	FC-0044
VascuLife VEGF Medium Complete Kit	LifeLine Technology	LL-0003
TrypKit	LifeLine	LL-0013
Saponin	Riedel-de Haen	16109
Gentamicin Sulfate Salt	Sigma-Aldrich	G-1264
Metronidazole	Sigma-Aldrich	M-3761
BCECF-AM	LifeTechnologies	B1150
TRITC Phalloidin	Sigma-Aldrich	P1951
18 mm Circular Coverslips	Electron Microscopy Sciences	72222-01
VectaShield Mounting Medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200