En kræftcelle Sfæroide Assay til at vurdere Invasion i en 3D-indstilling
Summary
This method evaluates cancer cell invasion from spheroids into a surrounding 3D matrix. Spheroids are generated via the hanging drop culture method and then embedded in a matrix comprised of basement membrane materials and type I collagen. Invasion out of the spheroids is subsequently monitored.
Abstract
The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential. Most traditional assays, however, do not examine these invasive features in a three-dimensional environment and the resulting data suffer from reduced biological applicability. Here an approach is presented to visualize the invasive ability of cell lines in a physiologically relevant setting. The cancer cell spheroid invasion assay first utilizes gravity to generate spheroids within drops of media that hang from the lid of a cell culture dish. Next, these spheroids are embedded in a 3D matrix consisting of a mixture of basement membrane materials and type I collagen. Cancer cell egression from the spheroids into the surrounding matrix is then monitored over time. The method described here can be modified to examine invasion after coculture of different cell types, inclusion of drugs/inhibitors, or alterations in extracellular matrix (ECM) constituents.
Introduction
Det er fastslået, at kræftcellen motilitet er prædiktiv for metastatisk potentiale, idet en sådan adfærd letter invasion gennem basalmembranen og ibrugtagning kredsløbssystemet 1. De fleste forskning om motilitet har fokuseret på, hvordan celler opfører sig i en to-dimensionel (2D) indstilling, selv om det er ved at blive almindeligt anerkendt, at bevægelsen af celler i et tredimensionelt (3D) matrix er mere repræsentativ for, hvordan disse samme celler rent faktisk vil opfører in vivo 2. 3D-kultur-systemer anvendes i stigende grad til at studere cellulære adfærd, der spænder fra cellemorfologi, til vækst kinetik og narkotika følsomhed 3. Ønsket om at overvåge cancercelle invasion inden for rammerne af en 3D-miljø har ført til syntesen af tidligere etablerede teknikker involverer dannelsen af 3D-celleaggregater (sfæroider) via den hængende dråbe dyrkningsmetode 4, efterfulgt af indlejring af disse sfæroider i en 3D ekstracellulære matrix (ECM) bestående af kollagen og kælder membranmaterialer 5. Metoden anvendes til at forbedre disse tidligere etablerede teknikker ved at tilvejebringe en strømlinet tilgang, der let kan anvendes til at sammenligne invasion under en række eksperimentelle betingelser.
Mere traditionelle måder at vurdere cellemotilitet in vitro er scratch-viklet assay og transwell assay 6. Den tidligere assay viser cellemotiliteten i en 2D indstilling, og er derfor uafhængig af en række funktioner kritiske for in vivo invasion, f.eks proteaseaktivitet 7. Transwell assay kan invasion bedre modelcelle når brønden skær er belagt med ECM substrater, men kun en enkelt parameter, dvs. udseendet af celler på den modsatte membranoverfladen måles, og mange nuancer af celleinvasion er således ikke umiddelbart kan. I modsætning til disse teknikker, cancercellen klumpformet invasion assay (figur 1 </ strong>) giver mulighed for tidstro overvågning af celleinvasion i en indstilling, der ikke kun fysiologisk relevant, men også tillader vigtige cellelinje-specifikke funktioner, der skal visualiseres, såsom individuelle vs. kollektiv cellemigration 8. Denne fremgangsmåde giver også fordele i forhold til standard 3D vækstkultur assays. Frembringelsen af cellulære aggregater via hængende dråbe metoden oprindeligt begrænser celle bevægelse, således at celler vil blive tilskyndes til at invadere efter denne begrænsning løftes. Endvidere når denne begrænsning er løftet, vil cellen afstigning fortsætte på en ensartet retning, kan derefter hensigtsmæssigt kvantificeres.
De mest populære ECM materialer, der anvendes til kræft celle sfæroider analyser er Matrigel og type I collagen, hvor hver af disse komponenter har vigtige og adskilte roller i at påvirke metastatisk adfærd. Matrigel er en blanding af udskilte proteiner produceret af Engelbreth-Holm Swarm muse sarcoma celler og er beriget i basement membranproteiner, såsom laminin, entactin, og type IV-collagen 9. Af denne grund Matrigel er herefter benævnt "kælderen membranmaterialer." Disse basalmembran materialer giver væsentlige ligander er nødvendige for integrin adhæsion under cancercelle invasion 10 foruden mange andre proteiner, der udøver en række effekter på celleadfærd 11. I sammenligning type I collagen, der almindeligvis fremstilles ud fra syre fordøjelser af sener og andre tætte kollagene strukturer 12, er en meget enklere matrix, der tjener som et vigtigt strukturelt element af bindevæv og stroma støtte væv og organer i kroppen. Det er blevet påvist, at de fysiske egenskaber af kollagen kan regulere en række funktioner i cellemotilitet; for eksempel tilpasningen af kollagenfibriller ved tumor-stromal grænseflade tillader kræftceller efterfølgende migrerer langs disse fibriller, når invaderer stroma 13. I assayet præsenteres her, både type I collagen og kælder membranmaterialer anvendes som redskaber til undersøgelse 3D cancercelle-stroma interaktioner.
Effekten af hæmning eller stimulering af veje, der styrer kan overvåges invasion efter at cellerne er blevet indlejret i 3D matrix. Celler kan forbehandles under vækst i de hængende dråber eller ved overførsel til 3D kultur, afhængigt af om en langvarig behandling vil være nødvendigt at modulere invasion. For kortere behandlinger, anbefales det, at lægemidlet blandes med klumpformet suspensionen efter indsamling, samt medier, der vil omgive 3D kulturer, til at fremme passende lægemiddeleksponering til cellerne. Dernæst kan normale eller tumor-associerede stromaceller blandes med matrixmaterialet for at vurdere deres rolle i modulering tumorcelleinvasion eller at bestemme, hvordan parakrin og autokrin signalsystemer påvirkninger celle adfærd. Denne idé blev vist i en undersøgelse, hvor cokultur af colpå cancer og endotelceller i hængende dråber førte til en vaskulære netværk inden sfæroiderne 14. Endelig kan ECM bestanddele også ændres, som kræftcelle invasion er påvirket af forskellige substrater 15. Den nedenfor metode vil dermed skabe en ramme for vurdering af kræftcellen invasion under en række betingelser. Det blev generelt konstateret, at ikke alle cellelinjer vil skabe sfæroider i hængende dråber og epitelceller udseende cellelinjer typisk danner regelmæssige sfærer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dette studie vurderede effektiviteten af et panel af cancercellelinier i en klumpformet invasion assay (Tabel 1). Generelt finder vi, at sfæroide dannelse forstærkes i de mere epiteliale udseende cellelinjer, hvor tilstedeværelsen af celle-celle kryds fremmer dannelsen af en sfæroid-lignende arkitektur. Kendte cellelinjer, der har undergået en epitel-mesenchymale overgang, som MDA-MB-231-celler ikke danner sfæroider i hængende dråbe kultur sandsynligvis på grund af deres reducerede …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Støttet af NIH tilskud P30 CA051008 og T32 CA009686 (ATR).
Materials
| Matrigel Growth Factor Reduced | Corning | CB-40234 | |
| Collagen Type I, Rat Tail, 100 mg | Millipore | 08-115 | |
| DMEM | Life Technologies | 11995-065 | |
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 11875-093 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-12 | |
| 100mm TC-treated Dishes | Corning Incorporated | 430167 | |
| 24-well TC-treated Plates | NEST Biotechnlology | 702001 | |
| Olympus IX-71 Inverted Microscope | |||
| Cell lines were maintained in DMEM + 10% FBS, with the expection of BT-474 and LNCaP cells, which were mantained in RPMI + 10% FBS. | |||
References
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Metastasis: Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat Rev. Cancer. 2 (8), (2002).
- Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. J Cell Sci. 116 (12), 2377-2388 (2003).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), (2007).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. J Vis Exp. 51, (2011).
- Del Duca, ., Werbowetski, D., T, ., Del Maestro, R., F, Spheroid preparation from hanging drops: characterization of a model of brain tumor invasion. J Neuro-Oncol. 67 (3), (2004).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. J Vis Exp. 88, (2014).
- Ramos-DeSimone, N., Hahn-Dantona, E., Sipley, J., Nagase, H., French, D. L., Quigley, J. P. Activation of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) via a converging plasmin/stromelysin-1 cascade enhances tumor cell invasion. J Bio Chem. 274 (19), .
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Rev. Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: Basement membrane matrix with biological activity. Semin Cancer Biol. 15 (5), 378-386 (2005).
- Shaw, L. M., Chao, C., Wewer, U. M., Mercurio, A. M. Function of the integrin α6β1 in metastatic breast carcinoma cells assessed by expression of a dominant-negative receptor. Cancer Res. 56 (5), 959-963 (1996).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), (2010).
- Rajan, N., Habermehl, J., Coté, M. -. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat Protoc. 1 (6), (2006).
- Provenzano, P. P., Eliceiri, K. W., Campbell, J. M. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Med. 4 (1), (2006).
- Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method. Methods Mol Med. 140, 141-151 (2007).
- Brenner, W., Groß, S., Steinbach, F., Horn, S., Hohenfellner, R., Thüroff, J. W. Differential inhibition of renal cancer cell invasion mediated by fibronectin, collagen IV and laminin. Cancer Lett. 155, 199-205 (2000).
- Nieman, M. T., Prudoff, R. S., Johnson, K. R., Wheelock, M. J. N-cadherin promotes motility in human breast cancer cells regardless of their E-cadherin expression. J Cell Biol. 147 (3), .
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), (2013).
- Sodek, K. L., Brown, T. J., Ringuette, M. J. Collagen I but not Matrigel matrices provide an MMP-dependent barrier to ovarian cancer cell penetration. BMC Cancer. 8 (1), 223-2210 (2008).
- Nguyen-Ngoc, K. V., Ewald, A. J. Mammary ductal elongation and myoepithelial migration are regulated by the composition of the extracellular matrix. J Microsc. 251 (3), 212-223 (2013).
- Glinskii, A. B., Smith, B. A., Jiang, P., Li, X., Yang, M., Hoffman, R. M., Glinsky, G. V. Viable circulating metastatic cells produced in orthotopic but not ectopic prostate cancer models. Cancer Res. 63 (14), 4239-4243 (2003).
