कैंसर कोशिका उपगोल परख एक 3 डी सेटिंग में आक्रमण का आकलन करने के लिए
Summary
This method evaluates cancer cell invasion from spheroids into a surrounding 3D matrix. Spheroids are generated via the hanging drop culture method and then embedded in a matrix comprised of basement membrane materials and type I collagen. Invasion out of the spheroids is subsequently monitored.
Abstract
The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential. Most traditional assays, however, do not examine these invasive features in a three-dimensional environment and the resulting data suffer from reduced biological applicability. Here an approach is presented to visualize the invasive ability of cell lines in a physiologically relevant setting. The cancer cell spheroid invasion assay first utilizes gravity to generate spheroids within drops of media that hang from the lid of a cell culture dish. Next, these spheroids are embedded in a 3D matrix consisting of a mixture of basement membrane materials and type I collagen. Cancer cell egression from the spheroids into the surrounding matrix is then monitored over time. The method described here can be modified to examine invasion after coculture of different cell types, inclusion of drugs/inhibitors, or alterations in extracellular matrix (ECM) constituents.
Introduction
यह कैंसर सेल गतिशीलता इस तरह के व्यवहार संचार प्रणाली 1 में तहखाने झिल्ली और प्रवेश के माध्यम से आक्रमण की सुविधा दी है कि, मेटास्टेटिक क्षमता का भविष्य कहनेवाला है कि स्थापित है। गतिशीलता पर अधिकांश अनुसंधान यह व्यापक रूप से एक तीन आयामी (3 डी) मैट्रिक्स में कोशिकाओं के आंदोलन होगा वास्तव में कैसे ये वही कोशिकाओं के अधिक प्रतिनिधि है कि मान्यता प्राप्त होता जा रहा है, हालांकि कोशिकाओं, एक दो आयामी (2 डी) की स्थापना में कैसे व्यवहार पर ध्यान केंद्रित किया है विवो 2 में व्यवहार करते हैं। 3 डी संस्कृति सिस्टम तेजी से विकास कैनेटीक्स और दवा संवेदनशीलता से 3, सेल आकृति विज्ञान से लेकर है कि सेलुलर व्यवहार का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। एक 3 डी वातावरण के संदर्भ में कैंसर सेल आक्रमण की निगरानी करने की इच्छा एक 3 डी कोशिकी में इन spheroids embedding द्वारा पीछा फांसी ड्रॉप संस्कृति विधि 4, के माध्यम से 3 डी सेल समुच्चय (spheroids) की पीढ़ी से जुड़े पहले से स्थापित तकनीक के संश्लेषण के लिए प्रेरित किया मैट्रिक्स (ईमुख्यमंत्री) कोलेजन और तहखाने झिल्ली सामग्री 5 की रचना की। इस विधि को आसानी से प्रयोगात्मक स्थितियों की एक किस्म के तहत आक्रमण की तुलना करने के लिए उपयोग किया जा सकता है कि एक सुव्यवस्थित दृष्टिकोण प्रदान करके इन पहले से स्थापित तकनीक को बेहतर बनाने का प्रयास है।
इन विट्रो में सेल गतिशीलता का आकलन करने के लिए और अधिक परंपरागत तरीके खरोंच घाव परख और transwell परख 6 हैं। पूर्व परख एक 2 डी सेटिंग में सेल गतिशीलता को दर्शाया गया है, और इन विवो आक्रमण के लिए महत्वपूर्ण सुविधाओं की एक किस्म है, जैसे प्रोटीज गतिविधि 7 की इसलिए स्वतंत्र है। transwell परख अच्छी तरह से सम्मिलित करता विपरीत झिल्ली सतह पर कोशिकाओं की उपस्थिति यानी, ईसीएम substrates लेकिन, केवल एक ही पैरामीटर के साथ बेहतर मॉडल सेल आक्रमण लेपित हैं कर सकते हैं जब मापा जाता है, और सेल आक्रमण की कई बारीकियों इस तरह आसानी से नमूदार नहीं कर रहे हैं। इन तकनीकों, कैंसर सेल अंडाकार आकृति आक्रमण परख (चित्रा 1 <के विपरीत/ Strong>) केवल physiologically प्रासंगिक नहीं है कि एक सेटिंग में सेल आक्रमण की वास्तविक समय की निगरानी के लिए अनुमति देता है, लेकिन यह भी इस तरह के सामूहिक बनाम व्यक्तिगत सेल प्रवास 8 रूप में देखे जा करने के लिए महत्वपूर्ण सेल लाइन विशेष सुविधाओं, परमिट। इस विधि को भी मानक 3 डी संस्कृति के विकास assays से अधिक लाभ देता है। कोशिकाओं इस बाधा को उठा लिया है के बाद आक्रमण करने के लिए प्रोत्साहित किया जाएगा ताकि फांसी ड्रॉप विधि के माध्यम से सेलुलर समुच्चय की पीढ़ी के शुरू में, सेल आंदोलन constrains। कि बाधा उठाया है एक बार इसके अलावा, सेल निकास फिर आसानी से quantitated जा सकता है कि एक समान दिशा में आगे बढ़ना होगा।
कैंसर कोशिका spheroids assays के लिए इस्तेमाल सबसे लोकप्रिय ईसीएम सामग्री Matrigel कर रहे हैं और इनमें से प्रत्येक घटक मेटास्टेटिक व्यवहार को प्रभावित करने में महत्वपूर्ण और विशिष्ट भूमिका है जहां प्रकार मैं, कोलेजन। Matrigel Engelbreth-होल्म झुंड माउस सार्कोमा कोशिकाओं द्वारा उत्पादित प्रोटीन की एक स्रावित मिश्रण है, और baseme में समृद्ध हैऐसे laminin, entactin, और प्रकार चतुर्थ कोलेजन के रूप में 9 NT झिल्ली प्रोटीन। इस कारण से Matrigel आगे के रूप में जाना जाता है "तहखाने झिल्ली सामग्री है।" ये तहखाने झिल्ली सामग्री सेल व्यवहार 11 पर प्रभाव की एक सीमा डालती है कि कई अन्य प्रोटीन के अलावा कैंसर सेल आक्रमण 10 के दौरान आसंजन integrin के लिए आवश्यक आवश्यक ligands प्रदान करते हैं। इसकी तुलना में, आमतौर पर tendons और अन्य घने श्लेषजनउत्पादी संरचनाओं 12 की एसिड हज़म से तैयार I कोलेजन प्रकार, शरीर के संयोजी ऊतक और स्ट्रोमा समर्थन ऊतकों और अंगों का एक प्रमुख संरचनात्मक तत्व के रूप में कार्य करता है कि एक बहुत सरल मैट्रिक्स सामग्री है। यह कोलेजन की शारीरिक विशेषताओं सेल गतिशीलता की सुविधाओं की एक संख्या को नियंत्रित कर सकते हैं कि प्रदर्शन किया गया है; उदाहरण के लिए, ट्यूमर स्ट्रोमल इंटरफेस में कोलेजन तंतुओं के संरेखण स्ट्रोमा 13 में हमलावर जब बाद में उन तंतुओं के साथ विस्थापित करने के लिए कैंसर की कोशिकाओं को परमिट। यहाँ प्रस्तुत परख में, दोनों प्रकार I कोलेजन और तहखाने झिल्ली सामग्री 3 डी कैंसर सेल स्ट्रोमा बातचीत का अध्ययन करने के लिए उपकरण के रूप में उपयोग किया जाता है।
कोशिकाओं 3 डी मैट्रिक्स में एम्बेडेड गया है के बाद आक्रमण नजर रखी जा सकती है कि नियंत्रण रास्ते के अवरोध या उत्तेजना का प्रभाव। प्रकोष्ठों फांसी बूंदों में या एक लंबा उपचार आक्रमण व्यवस्थित करना आवश्यक हो जाएगा, इस पर निर्भर 3D संस्कृति, करने के लिए स्थानांतरण पर विकास के दौरान pretreated जा सकता है। छोटे कद के उपचार के लिए, यह दवा संग्रह के बाद अंडाकार आकृति निलंबन, साथ ही कोशिकाओं के लिए पर्याप्त दवा जोखिम की सुविधा के लिए, 3 डी संस्कृतियों चारों ओर जाएगा कि मीडिया के साथ मिलाया जा सिफारिश की है। इसके बाद, सामान्य या ट्यूमर जुड़े stromal कोशिकाओं ट्यूमर सेल आक्रमण नियमन करने में उनकी भूमिका का मूल्यांकन करने के लिए, या कैसे पैराक्राइन और ऑटोक्राइन संकेतन प्रभावों सेल व्यवहार का निर्धारण करने के लिए मैट्रिक्स सामग्री के साथ admixed जा सकता है। यह विचार एक अध्ययन में दिखाया गया था, जहां कर्नल के cocultureकैंसर और फांसी बूंदों में endothelial कोशिकाओं पर spheroids 14 के भीतर एक संवहनी नेटवर्क का नेतृत्व किया। कैंसर सेल आक्रमण विभिन्न substrates 15 पर असर पड़ा है के रूप में अंत में, ईसीएम घटक भी, बदला जा सकता है। नीचे प्रस्तुत विधि इस प्रकार की स्थिति की एक किस्म के तहत कैंसर सेल आक्रमण का आकलन करने के लिए एक रूपरेखा प्रदान करेगा। सामान्य तौर पर यह सब सेल लाइनों फांसी बूंदों में spheroids पैदा करेगा और उपकला दिखने सेल लाइनों आम तौर पर नियमित क्षेत्रों फार्म नहीं कि पाया गया था।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस अध्ययन में एक अंडाकार आकृति आक्रमण परख (तालिका 1) में कैंसर कोशिका लाइनों के एक पैनल के प्रदर्शन का मूल्यांकन किया। आम तौर पर, हम अंडाकार आकृति गठन सेल सेल जंक्शनों की उपस्थिति एक अंडाकार आकृति…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
एनआईएच अनुदान P30 CA051008 और T32 CA009686 (एटीआर) द्वारा समर्थित है।
Materials
| Matrigel Growth Factor Reduced | Corning | CB-40234 | |
| Collagen Type I, Rat Tail, 100 mg | Millipore | 08-115 | |
| DMEM | Life Technologies | 11995-065 | |
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 11875-093 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-12 | |
| 100mm TC-treated Dishes | Corning Incorporated | 430167 | |
| 24-well TC-treated Plates | NEST Biotechnlology | 702001 | |
| Olympus IX-71 Inverted Microscope | |||
| Cell lines were maintained in DMEM + 10% FBS, with the expection of BT-474 and LNCaP cells, which were mantained in RPMI + 10% FBS. | |||
References
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Metastasis: Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat Rev. Cancer. 2 (8), (2002).
- Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. J Cell Sci. 116 (12), 2377-2388 (2003).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), (2007).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. J Vis Exp. 51, (2011).
- Del Duca, ., Werbowetski, D., T, ., Del Maestro, R., F, Spheroid preparation from hanging drops: characterization of a model of brain tumor invasion. J Neuro-Oncol. 67 (3), (2004).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. J Vis Exp. 88, (2014).
- Ramos-DeSimone, N., Hahn-Dantona, E., Sipley, J., Nagase, H., French, D. L., Quigley, J. P. Activation of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) via a converging plasmin/stromelysin-1 cascade enhances tumor cell invasion. J Bio Chem. 274 (19), .
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Rev. Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: Basement membrane matrix with biological activity. Semin Cancer Biol. 15 (5), 378-386 (2005).
- Shaw, L. M., Chao, C., Wewer, U. M., Mercurio, A. M. Function of the integrin α6β1 in metastatic breast carcinoma cells assessed by expression of a dominant-negative receptor. Cancer Res. 56 (5), 959-963 (1996).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), (2010).
- Rajan, N., Habermehl, J., Coté, M. -. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat Protoc. 1 (6), (2006).
- Provenzano, P. P., Eliceiri, K. W., Campbell, J. M. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Med. 4 (1), (2006).
- Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method. Methods Mol Med. 140, 141-151 (2007).
- Brenner, W., Groß, S., Steinbach, F., Horn, S., Hohenfellner, R., Thüroff, J. W. Differential inhibition of renal cancer cell invasion mediated by fibronectin, collagen IV and laminin. Cancer Lett. 155, 199-205 (2000).
- Nieman, M. T., Prudoff, R. S., Johnson, K. R., Wheelock, M. J. N-cadherin promotes motility in human breast cancer cells regardless of their E-cadherin expression. J Cell Biol. 147 (3), .
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), (2013).
- Sodek, K. L., Brown, T. J., Ringuette, M. J. Collagen I but not Matrigel matrices provide an MMP-dependent barrier to ovarian cancer cell penetration. BMC Cancer. 8 (1), 223-2210 (2008).
- Nguyen-Ngoc, K. V., Ewald, A. J. Mammary ductal elongation and myoepithelial migration are regulated by the composition of the extracellular matrix. J Microsc. 251 (3), 212-223 (2013).
- Glinskii, A. B., Smith, B. A., Jiang, P., Li, X., Yang, M., Hoffman, R. M., Glinsky, G. V. Viable circulating metastatic cells produced in orthotopic but not ectopic prostate cancer models. Cancer Res. 63 (14), 4239-4243 (2003).
