טיהור וקפל שוב לעמילואיד סיבים של (שלו)<sub> 6</sub> חלבון רקומביננטי Shadoo -tagged מבוטא גופי הכללה ב<em> חיידק</em
Summary
A two-step chromatographic method is described for the purification of recombinant Shadoo protein expressed as inclusion bodies in Escherichia coli, as well as a protocol to fibrillate purified Shadoo into amyloid structures.
Abstract
מערכת ביטוי coli Escherichia היא כלי רב עוצמה לייצור חלבונים רקומביננטיים האיקריוטים. אנחנו משתמשים בו כדי לייצר Shadoo, חלבון השייך למשפחת הפריון. שיטת chromatographic לטיהור 6 -tagged Shadoo רקומביננטי (שלו) הביעה כגופי הכללה מתואר. גופי הכללתם בsolubilized 8 M אוריאה ומחויב לטור Ni 2 + -charged לבצע כרומטוגרפיה זיקת יון. חלבוני Bound הם eluted על ידי שיפוע של imidazole. שברים המכילים חלבון Shadoo נתונים לכרומטוגרפיה הדרת הגודל להשיג חלבון נקי במיוחד. בShadoo הצעד מטוהר הסופי desalted להסיר מלחים, אוריאה וimidazole. חלבון Shadoo רקומביננטי הוא מגיב חשוב למחקרים ביו-פיסיקליים וביוכימיים של הפרעות קונפורמציה חלבון המתרחשות במחלות הפריון. דיווחים רבים הראו כי מחלות ניווניות הפריון מקורן בתצהיר של דקירהle, הורה סיבי עמילואיד. פרוטוקולי מדגם מתארים כיצד לרעוד Shadoo לסיבי עמילואיד בחומץ וניטראלי / PHS הבסיסי מוצגים. השיטות על איך לייצר ולרעוד Shadoo יכול להקל על מחקר במעבדות עובדות על מחלות הפריון, שכן הוא מאפשר לייצור כמויות הגדולות של חלבון באופן מהיר ועלות נמוך.
Introduction
מחלות ניווניות הפריון, הכוללות אנצפלופתיה שור ספגת בבקר, כבשים ומרוסקים במחלת קרויצפלד-יעקב בבני אדם, הן קטלניות וחשוכות מרפא. מחלות הפריון מתאפיינות בשינויי קונפורמציה חלבון הפריון הסלולרי של בעיקר מורכבים מα-סלילים, ל- β גיליון הצלב מועשר עמילואיד קונפורמיסט 1,2. צלב-β-מבנים מכילים צפופים וβ גליונות כמו גבישים-הורה מאוד התייצבו עם קשרי מימן 3,4. amyloids הפריון יכול לשכפל את עצמו בשל β-הגדילים בקצה הגובר המספקים תבנית לגיוס והמרת יחידת חלבון monomeric.
על פי "חלבון רק" ההשערה, קונפורמיסט עמילואיד חלבון הפריון שלו הגורם המדבק הבלעדי. עם זאת, כמה מולקולות ביולוגיות אחרות הוצעו להיות חיוני להפרעות הפריון. למשל, קרום תא נחשב למקום שבו conversiבמתרחש וכמה שומנים טעונים שלילי הוכחו כדי לשפר את 5,6 תהליך הגיור. בנוסף, חלק מהחלבונים יכולים להיות גם מעורבים בפתולוגיות הפריון. באופן ספציפי, יש שני חברים אחרים במשפחת חלבון הפריון: דופל וShadoo 7,8. יש דופל מבנה קשיח יחסית התייצב עם גשרים די-גופרי ולא מצליח לפלמר עצמי ומצטבר לסיבי עמילואיד 9. לעומת זאת, דומה לחלבון הפריון, Shadoo יכול לאמץ מבנה מועשר-β גיליון ולשייך עצמי למבני ליפון עמילואיד. זה היה הראה כי Shadoo יכול לרעוד בתנאים מקומיים או על כריכת קרומים טעונים שלילי 10,11. המרה של Shadoo לתוך סיבים כמו עמילואיד-עשויה להיות קשורה לפתולוגיות. ואכן, המנגנונים שבאמצעותם מבנים דמויים-עמילואיד לגרום למחלות הם הבינו היטב.
Shadoo נושא תחום הידרופובי (HD) וסדרה של טנדם Arg / גלאי חוזר לא דומהo חלק N- מסוף חלבון הפריון (איור 1 א) של. כחלק N- מסוף חלבון הפריון של, Shadoo הוא מאוד טעון חיובי ונראה כי חלבון מקורי לא מובנה 11,12. נראה Shadoo להיות פונקציונלי קשור להפרעות הפריון מאז אותו ישירות יכול להיקשר חלבון הפריון. בנוסף, הביטוי שלה מוסדר נחלש במהלך פתולוגיה הפריון 13,14. עם זאת, התפקיד של Shadoo במחלת הפריון עדיין לא הוקם.
פיתחנו פלסמיד שנשא את רצף הקידוד של גן Shadoo העכבר. פלסמיד שימש להפוך E. coli לייצור חלבון Shadoo N-מסופו 6 היתוך של. מערכת ביטוי זה מבוסס היטב במעבדה שלנו ומשמשת בדרך כלל בפרויקטים המתמשכים שלנו 6,15,16. נושא חשוב לביטוי של Shadoo הוא הבחירה של א ' זן coli. בעוד זן חיידקי BL21 המוסמך משמש בדרך כלל לביטוי של פרו רקומביננטיחלבוני Shadoo בא לידי הביטוי בהצלחה וטיהר רק מזן החיידקים הפך SoluBL21. SoluBL21 א המוסמך coli הוא מוטציה משופרת של זן מארח BL21 פיתחה לייצור חלבוני ביטויו בBL21 ההורה לא נתן שום מוצר מסיס לזיהוי. ביטוי ברמה גבוהה של Shadoo בSoluBL21 E. coli מוביל להצטברות של החלבון בגוף הכללה. כתכונה כללית, כאשר חלבון שאינו ילידי הארץ באה לידי הביטוי ביותר בE. coli, חלבון זה נוטה להצטבר בגוף הכללה מסיס. Shadoo כנראה צובר באמצעות אינטראקציות שאינן קוולנטיים הידרופובי או יוניות (או שילוב של שניהם) למבנים דינמיים מועשרים שהוקמו על ידי החלבון המקופל לדרגות שונות. כתוצאה מכך, הטיהור כוללת לפחות שני שלבים: (i) הפרדה סלקטיבית של החלבון ממולקולות ביולוגיות אחרות במדיום denaturation, וכן (ii) renaturation של החלבון המטוהר באמצעות בקיפול מבחנהטכניקות.
ההפרדה סלקטיבית של Shadoo הושגה בפתרון מאגר המכיל אוריאה 8M (או לחלופין 6M guanidine-HCl). הסרת האוריאה וrenaturation של החלבון יכולים להיעשות על ידי יישום פרוטוקולים שונים: renaturation (i) בפתרון ה- pH חומצי לקבל חלבון בלתי מובנה monomeric Shadoo, או (ii) renaturation בפתרון של pH ≥ 7 להשיג polymerized Shadoo לסיבי עמילואיד יציבים עם מוטיבים-β גיליון צלב אופייניים.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול קל ויעיל לשני ביטוי וטיהור של כמות גדולה של חלבון Shadoo עכבר רקומביננטי מוצג. השיטה המתוארת מאפשרת solubilization וטיהור (6) -tagged חלבון רקומביננטי Shadoo מוצלחים. חשוב, כפי שציינו בכותרת, שכאשר באו לידי ביטוי בחיידק E. פרוקריוטים coli Shadoo מצטבר בגופי הכללה. ל?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge Natalie Doude and David Westerway (University of Alberta) for providing us Sho cDNA, Christophe Chevalier (INRA) for plasmid construction, Michel Brémont (INRA) for providing us BL21Sol bacteria; Christine Longin (INRA) for TEM assistance and Edith Pajot-Augy (INRA) for comments and proofreading.
Materials
| AKTA FPLC | GE, Amersham | # 1363 | |
| HiLoad 16/60 Superdex | GE Healthcare | 17-1069-01 | |
| HiTrap IMAC | GE Healthcare | GE17-0920-05 | |
| HiPrep26/10 Desalting column | GE Healthcare | GE17-5087-01 | |
| SoluBL21 Competent E. coli | Genlantis | C700200 | |
| pET-28b+ | Novogen | 69865-3 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| LB-Broth medium | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Eppendorf Biophotometar | Eppendorf | 550507804 | |
| Trito X-100 | Life Technologies | 85111 | |
| NiSO4 | Sigma-Aldrich | 656895 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | RES3098T | |
| Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 4693116001 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 746398 | |
| Imidazol | Sigma-Aldrich | I5513 | |
| Gdn-HCl | Sigma-Aldrich | G4505 | |
| protein size marker | Thermo Fisher Scientific | 26620 |
References
- Biasini, E., Turnbaugh, J. A., Unterberger, U., Harris, D. A. Prion protein at the crossroads of physiology and disease. Trends in Neurosciences. 35, 92-103 (2012).
- Colby, D. W., Prusiner, S. B. De novo generation of prion strains. Nature Reviews. Microbiology. 9, 771-777 (2011).
- Chiti, F., Dobson, C. M. Protein misfolding, functional amyloid, and human disease. Annual Review of Biochemistry. 75, 333-366 (2006).
- Nelson, R., et al. Structure of the cross-beta spine of amyloid-like fibrils. Nature. 435, 773-778 (2005).
- Murphy, R. M. Kinetics of amyloid formation and membrane interaction with amyloidogenic proteins. Biochimica et Biophysica Acta. 1768, 1923-1934 (2007).
- Steunou, S., Chich, J. F., Rezaei, H., Vidic, J. Biosensing of lipid-prion interactions: insights on charge effect, Cu(II)-ions binding and prion oligomerization. Biosensors & Bioelectronics. 26, 1399-1406 (2010).
- Watts, J. C., Westaway, D. The prion protein family: diversity, rivalry, and dysfunction. Biochimica et Biophysica Acta. 1772, 654-672 (2007).
- Westaway, D., Daude, N., Wohlgemuth, S., Harrison, P. The PrP-like proteins Shadoo and Doppel. Topics in Current Chemistry. 305, 225-256 (2011).
- Baillod, P., Garrec, J., Tavernelli, I., Rothlisberger, U. Prion versus doppel protein misfolding: new insights from replica-exchange molecular dynamics simulations. Biochemistry. 52, 8518-8526 (2013).
- Daude, N., et al. Wild-type Shadoo proteins convert to amyloid-like forms under native conditions. Journal of Neurochemistry. 113, 92-104 (2010).
- Li, Q., et al. Shadoo binds lipid membranes and undergoes aggregation and fibrillization. Biochemical and Biophysical Research Communications. 438, 519-525 (2013).
- Watts, J. C., et al. The CNS glycoprotein Shadoo has PrP(C)-like protective properties and displays reduced levels in prion infections. The EMBO Journal. 26, 4038-4050 (2007).
- Watts, J. C., et al. Protease-resistant prions selectively decrease Shadoo protein. PLoS Pathogens. 7, e1002382 (2011).
- Westaway, D., et al. Down-regulation of Shadoo in prion infections traces a pre-clinical event inversely related to PrP(Sc) accumulation. PLoS Pathogens. 7, e1002391 (2011).
- Chevalier, C., et al. PB1-F2 influenza A virus protein adopts a beta-sheet conformation and forms amyloid fibers in membrane environments. The Journal of Biological Chemistry. 285, 13233-13243 (2010).
- Tarus, B., et al. Oligomerization paths of the nucleoprotein of influenza A virus. Biochimie. 94, 776-785 (2012).
- Biancalana, M., Koide, S. Molecular mechanism of Thioflavin-T binding to amyloid fibrils. Biochimica et Biophysica Acta. 1804, 1405-1412 (2010).
- Minic, J., Sautel, M., Salesse, R., Pajot-Augy, E. Yeast system as a screening tool for pharmacological assessment of g protein coupled receptors. Current Medicinal Chemistry. 12, 961-969 (2005).
- Schein, C. H. A cool way to make proteins. Nature Biotechnology. 22, 826-827 (2004).
- Sorensen, H. P., Mortensen, K. K. Advanced genetic strategies for recombinant protein expression in Escherichia coli. Journal of Biotechnology. 115, 113-128 (2005).
- Zhang, J., et al. Disruption of glycosylation enhances ubiquitin-mediated proteasomal degradation of Shadoo in Scrapie-infected rodents and cultured cells. Molecular Neurobiology. 49, 1373-1384 (2014).
- Englund, P. T. The structure and biosynthesis of glycosyl phosphatidylinositol protein anchors. Annual Review of Biochemistry. 62, 121-138 (1993).
- Puig, B., Altmeppen, H., Glatzel, M. The GPI-anchoring of PrP: implications in sorting and pathogenesis. Prion. 8, 11-18 (2014).
