Purificación y replegamiento de amiloide fibrillas de (Su)<sub> 6</sub>-etiquetados proteína recombinante Shadoo Expresado como cuerpos de inclusión en<em> E. coli</em
Summary
A two-step chromatographic method is described for the purification of recombinant Shadoo protein expressed as inclusion bodies in Escherichia coli, as well as a protocol to fibrillate purified Shadoo into amyloid structures.
Abstract
El sistema de expresión de Escherichia coli es una poderosa herramienta para la producción de proteínas recombinantes eucariotas. Lo utilizamos para producir Shadoo, una proteína perteneciente a la familia de priones. Un método cromatográfico para la purificación de (His) 6-etiquetados Shadoo recombinantes expresadas como cuerpos de inclusión se describe. Los cuerpos de inclusión se solubilizan en 8 M urea y unidos a una columna de Ni 2+ -charged para llevar a cabo la cromatografía de afinidad de iones. Las proteínas unidas se eluyen mediante un gradiente de imidazol. Las fracciones que contienen la proteína Shadoo son sometidas a cromatografía de exclusión por tamaño para obtener una proteína altamente purificada. En la etapa final de Shadoo purificada se desala para eliminar las sales, urea e imidazol. Shadoo proteína recombinante es un reactivo importante para los estudios biofísicos y bioquímicos de los trastornos de la conformación de proteínas que ocurren en las enfermedades priónicas. Muchos informes han demostrado que las enfermedades neurodegenerativas causadas por priones originan a partir de la deposición de puñaladale ordenó fibrillas amiloides. / Se presentan valores de pH básicos protocolos de ejemplo que describen cómo fibrilar Shadoo en fibrillas amiloides en ácido y neutro. Los métodos sobre cómo producir y fibrilar Shadoo puede facilitar la investigación en laboratorios que trabajan sobre las enfermedades priónicas, ya que permite la producción de grandes cantidades de proteína en una manera rápida y de bajo coste.
Introduction
Enfermedades neurodegenerativas causadas por priones, que incluyen la encefalopatía espongiforme bovina en el ganado, la tembladera en las ovejas y la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob en humanos, son fatales e incurable. Las enfermedades priónicas se caracterizan por cambios conformacionales de la proteína priónica celular compuestos principalmente de alfa-hélices, en el β-hoja de cruz enriquecido amiloide confórmero 1,2. Cruz-ß-estructuras contienen densas y ß-hojas-cristalinas como altamente ordenadas estabilizados con enlaces de hidrógeno 3,4. Amiloides priónicas puede auto-replicarse debido a los beta-capítulos en el borde de crecimiento que proporcionan una plantilla para el reclutamiento y la conversión de una unidad de proteína monomérica.
De acuerdo con la hipótesis de "única proteína", el confórmero de amiloide de la proteína prión es el único agente infeccioso. Sin embargo, se han propuesto algunas otras biomoléculas ser esencial para los trastornos por priones. Por ejemplo, las membranas celulares se cree que ser un lugar donde conversien su lugar y algunos toma lípidos cargados negativamente se ha demostrado para mejorar el proceso de conversión de 5,6. Además, algunas proteínas también pueden estar implicados en patologías priónicas. En concreto, hay otros dos miembros de la familia de proteínas de priones: Doppel y Shadoo 7,8. Doppel tiene una estructura relativamente rígida estabilizado con puentes di-sulfuro y no autopolimerizarse y el agregado de fibrillas amiloides 9. En contraste, similar a la proteína prión, Shadoo puede adoptar una estructura enriquecida en β-lámina y autoasociarse en estructuras de fibrillas amiloides. Se demostró que Shadoo puede fibrilar en condiciones nativas o tras la unión membranas cargadas negativamente 10,11. La conversión de Shadoo en fibras de tipo amiloide puede estar asociada con patologías. De hecho, los mecanismos por los cuales las estructuras de tipo amiloide causan la enfermedad son poco conocidos.
Shadoo tiene un dominio hidrófobo (HD) y una serie de tándem Arg / Gly repite t similareso la parte N-terminal de la proteína prión (Figura 1A). A medida que la parte N-terminal de la proteína prión, Shadoo está altamente cargado positivamente y parece ser una proteína nativa no estructurada 11,12. Shadoo parece ser funcionalmente relacionadas con los trastornos por priones, ya que puede unirse directamente la proteína del prión. Además, su expresión es regulada hacia abajo durante la patología prión 13,14. Sin embargo, el papel de Shadoo en la enfermedad priónica todavía no se ha establecido.
Hemos desarrollado un plásmido que porta la secuencia de codificación del gen Shadoo ratón. El plásmido se utilizó para transformar E. coli para la producción de N-terminal Su proteína Shadoo 6 de fusión. Este sistema de expresión está bien establecida en nuestro laboratorio y se utiliza comúnmente en nuestros proyectos en curso 6,15,16. Una cuestión importante para la expresión de Shadoo es la elección de la E. coli cepa. Mientras cepa bacteriana BL21 competente se utiliza comúnmente para la expresión de pro recombinanteproteínas Shadoo se expresó y se purifica sólo de la cepa bacteriana transformada SoluBL21 éxito. SoluBL21 E. competente coli es un mutante mejorada de cepa huésped BL21 desarrollado para la producción de proteínas cuya expresión en la BL21 padre no dio producto soluble detectable. Una expresión de alto nivel de Shadoo en SoluBL21 E. coli conduce a la acumulación de la proteína en cuerpos de inclusión. Como característica general, cuando una proteína no nativa es altamente expresado en E. coli, esta proteína tiende a acumularse en los cuerpos de inclusión insolubles. Shadoo probablemente agregados a través de interacciones hidrófobas no covalentes o iónicos (o una combinación de ambos) para estructuras dinámicas altamente enriquecido formadas por la proteína plegada en diversos grados. En consecuencia, la purificación comprende al menos dos etapas: (i) una separación selectiva de la proteína a partir de otras biomoléculas en un medio de desnaturalización, y (ii) una renaturalización de la proteína purificada utilizando en el plegamiento in vitrotécnicas.
La separación selectiva de Shadoo se logró en una solución tampón que contiene urea 8 M (o, alternativamente, guanidina-HCl 6 M). La eliminación de urea y de la renaturalización de la proteína se puede hacer mediante la aplicación de diversos protocolos de: (i) la renaturalización en una solución de pH ácido para obtener una proteína Shadoo monomérica no estructurada, o (ii) la renaturalización en una solución de pH ≥ 7 para obtener Shadoo polimerizado en fibras amiloides estables con motivos característicos cruz β-hoja.
Protocol
Representative Results
Discussion
Se presenta un protocolo fácil y eficiente tanto para la expresión y purificación de una gran cantidad de proteína Shadoo recombinante de ratón. El método descrito permite la solubilización y purificación de (Su 6) proteína recombinante Shadoo-etiquetados éxito. Es importante, como se ha señalado en el título, que cuando se expresa en una bacteria procariota E. coli Shadoo se acumula en cuerpos de inclusión. Antes de la purificación Shadoo, las bacterias tienen que ser lisadas por sonic…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge Natalie Doude and David Westerway (University of Alberta) for providing us Sho cDNA, Christophe Chevalier (INRA) for plasmid construction, Michel Brémont (INRA) for providing us BL21Sol bacteria; Christine Longin (INRA) for TEM assistance and Edith Pajot-Augy (INRA) for comments and proofreading.
Materials
| AKTA FPLC | GE, Amersham | # 1363 | |
| HiLoad 16/60 Superdex | GE Healthcare | 17-1069-01 | |
| HiTrap IMAC | GE Healthcare | GE17-0920-05 | |
| HiPrep26/10 Desalting column | GE Healthcare | GE17-5087-01 | |
| SoluBL21 Competent E. coli | Genlantis | C700200 | |
| pET-28b+ | Novogen | 69865-3 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| LB-Broth medium | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Eppendorf Biophotometar | Eppendorf | 550507804 | |
| Trito X-100 | Life Technologies | 85111 | |
| NiSO4 | Sigma-Aldrich | 656895 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | RES3098T | |
| Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 4693116001 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 746398 | |
| Imidazol | Sigma-Aldrich | I5513 | |
| Gdn-HCl | Sigma-Aldrich | G4505 | |
| protein size marker | Thermo Fisher Scientific | 26620 |
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