كفاءة الثدييات التعبير خلية وخطوة واحدة خارج الخلية تنقية البروتينات السكرية لبلورة
Summary
This is a quick, cost-efficient protocol for the production of secreted, glycosylated mammalian proteins and subsequent single-step purification with sufficient yields of homogenous protein for X-ray crystallography and other biophysical studies.
Abstract
Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time and cost efficient protocol for secreted protein expression in mammalian cells and one step purification using nickel affinity chromatography. The system is based on large scale transient transfection of mammalian cells in suspension, which greatly decreases the time to produce protein, as it eliminates steps, such as developing expression viruses or generating stable expressing cell lines. This protocol utilizes cheap transfection agents, which can be easily made by simple chemical modification, or moderately priced transfection agents, which increase yield through increased transfection efficiency and decreased cytotoxicity. Careful monitoring and maintaining of media glucose levels increases protein yield. Controlling the maturation of native glycans at the expression step increases the final yield of properly folded and functional mammalian proteins, which are ideal properties to pursue X-ray crystallography. In some cases, single step purification produces protein of sufficient purity for crystallization, which is demonstrated here as an example case.
Introduction
فهم بنية البروتين على المستوى الذري هو المفتاح لكشف الأساس الجزيئي للمسارات البيولوجية والأمراض. الأشعة السينية البروتين البلورات هي / طريقة المطبق الأكثر استخداما لتحديد هياكل الجزيئات. التحدي الرئيسي لهذه الطريقة هو الحصول على كميات كافية من مطوية بشكل صحيح، البروتين النقي. هذا يصبح قضية خاصة عندما تعمل مع البروتينات الثدييات يفرز، التي تخضع التعديلات بعد متعدية محددة.
البروتينات أعرب البكتريا-هي المصدر الرئيسي للبروتينات تبلور المودعة في بنك معلومات البروتين 1. ويفضل أنظمة التعبير البكتيرية إلى حد كبير لأنها سريعة وغير مكلفة وتنتج غلة عالية من البروتين عادة. ومع ذلك، غالبا ما تكون غير مطوية بشكل صحيح المجالات خارج الخلية من البروتينات الثدييات أعرب في البكتيريا، التي مطلوبة refolding حالة وتنقية واسعة الخطوات للحصول على متجانس FOlded البروتين. بالإضافة إلى ذلك، العديد من البروتينات الثدييات تتطلب بالغليكوزيل آخر متعدية لتحقيق لطي السليم 2. على الرغم من أن التعبير وبالغليكوزيل في خلايا الخميرة أو الحشرات يمكن التغلب على مشكلة قابلة للطي، والتعديلات بعد متعدية، بما في ذلك بالغليكوزيل، تختلف كثيرا عن تلك الخلايا الثديية 3، مما أسفر عن البروتينات مع التعديلات غير صحيحة أو غير متجانسة.
خلايا الثدييات تعبر عن جميع الآلات الجزيئية اللازمة لضمان التعديلات في مرحلة ما بعد متعدية المناسبة وقابلة للطي. ومع ذلك، لا يفضل هذه الأنظمة التعبير عادة من قبل معظم المختبرات، وذلك بسبب عائدات محدودة وارتفاع تكاليف الكواشف والمواد الاستهلاكية. Polyethyleneimine (PEI)، وكاشف ترنسفكأيشن هو معيار رخيصة نسبيا ولكن يفرض السمية الخلوية كبيرة وانخفاض كفاءة ترنسفكأيشن، مما أدى إلى زيادة التكاليف في وسائل الإعلام خلية، DNA، وزراعة المعدات. العديد من البدائل لPEI باهظة التكاليف. نتناولهذه القضايا من خلال وصف مزيج من تحسين أدوات زراعة الخلايا ومعدلة كيميائيا PEI للطريقة سريعة وغير مكلفة نسبيا للتعبير عن البروتينات الثدييات يفرز، تليها خطوة واحدة تنقية. هذا الأسلوب القوي يعطي عوائد كافية للدراسات الفنية والبيوكيميائية 4، وفي بعض الحالات، يؤدي إلى بروتين قابلة للتبلور دون مزيد من التنقية.
يصف هذا البروتوكول العديد من التقنيات لتحقيق أقصى قدر من التعبير والاستسلام للبروتينات في الثدييات يفرز في الكلى الجنينية البشرية (HEK) 293F الخلايا المزروعة في التعليق. كفاءة ترنسفكأيشن (والتكلفة)، وإنتاج البروتين وتنقية كلها تتعزز بشكل كبير باتباع هذا البروتوكول. PEI تعديل بإضافة الكربانيت من خلال خطوة واحدة رد فعل عصابة فتح (PEI-TMC-25 والتركيب والخواص وصفها بالتفصيل في المرجع 5) يحسن إلى حد كبير كفاءة ترنسفكأيشن، ويقلل من السمية الخلوية من الموجبةاضطراب الغشاء، وبالتالي يقلل من تكاليف التجربة. وعلاوة على ذلك، بقاء الخلية وبروتين تعبير تحسنت كثيرا مع إضافة المكملات الثقافة لتوفير الجلوكوز والفيتامينات. الأهم لإنتاج البروتينات الغليكوزيلاتي، والمعاملة مع kifunensine، مثبط كيميائية غير سامة من مانوزيداز I، وتنتج البروتينات مع المعرفة، glycans غير الناضجة، والتي يمكن إزالتها بواسطة EndoHf endoglycosidase لانتاج البروتينات مع واحد N-acetylglucosamine في مكان كامل طول N-ربط غليكان 6. وأخيرا، فإن إفراز البروتينات في المصل خالية والمتوسطة محددة كيميائيا يسمح تنقية السريعة والسهلة للدراسات الهيكلية والبيوكيميائية. خطوة واحدة حامض والنيكل nitrilotriacetic (ني NTA) تنقية الراتنج يزيل معظم تلويث الأنواع في طاف، وفي بعض الحالات، يمكن أن تسفر عن بروتين من نقاء كافية لبلورة.
Protocol
Representative Results
Discussion
خلايا كلوة 293F تقدم إنتاج قوي من البروتينات التي تتطلب التعديلات بعد متعدية. هذا النظام يسمح التعبير السريع وقابلة للبروتينات مطوية أصلا تحتوي على ثنائي السلفيدات، بالغليكوزيل، والفسفرة التي لولاها تكون غائبة في استخدام المزيد من أدوات التعبير الروتينية. وبالإضافة…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH R01-HL119813 (to T.J.B.), American Lung Association RG-196051 (to T.J.B.), a CIMED Pilot and Feasibility grant (to T.J.B.), American Heart Association Predoctoral Fellowships 14PRE19970008 (to Z.Y.) and 15PRE22110004 (to D.L.K.).
Materials
| Culture Flasks | GeneMate | F-5909B | |
| 293 Freestyle Media | Gibco/Life Technologies | 12338-018 | |
| GlutaMAX | Gibco/Life Technologies | 35050-061 | Use in place of Glutamine |
| Hype 5 transfection reagent | Oz Biosciences | HY01500 | |
| 293fectin transfection reagent | Life Technologies | 12347019 | |
| PEI transfection reagent | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| Maxiprep Kit | Qiagen | 12162 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 30430 | |
| Endo Hf | NEB | P0703L | |
| Amylose Resin | NEB | E8021S | |
| Cell Boost R05.2 | HyClone | SH30584.02 | Cell Culture Supplement |
| GlucCell | CESCO Bioengineering | DG2032 | Glucose Monitoring System |
| Opti-MEM | Life Technologies | 519850.91 | Serum Free Medium for DNA transfection |
| Luria Broth (LB Media) | Life Technologies | 10855-001 | |
| GC10 Competent Cells | Sigma-Aldrich | G2919 |
References
- Meyer, S., et al. Multi-host expression system for recombinant production of challenging proteins. PLoS One. 8, e68674 (2013).
- Chang, V. T., et al. Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem. Structure. 15, 267-273 (2007).
- Rich, J. R., Withers, S. G. Emerging methods for the production of homogeneous human glycoproteins. Nat Chem Biol. 5, 206-215 (2009).
- Wu, K., et al. TREM-2 promotes macrophage survival and lung disease after respiratory viral infection. J Exp Med. 212, 681-697 (2015).
- Yang, C., et al. Mitigated cytotoxicity and tremendously enhanced gene transfection efficiency of PEI through facile one-step carbamate modification. Adv Healthc Mater. 2, 1304-1308 (2013).
- Elbein, A. D. Glycosidase inhibitors: inhibitors of N-linked oligosaccharide processing. FASEB J. 5, 3055-3063 (1991).
- Aricescu, A. R., Lu, W., Jones, E. Y. A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62, 1243-1250 (2006).
- Kelker, M. S., Debler, E. W., Wilson, I. A. Crystal structure of mouse triggering receptor expressed on myeloid cells 1 (TREM-1) at 1.76 A. J Mol Biol. 344, 1175-1181 (2004).
- Kober, D. L., et al. Preparation, crystallization, and preliminary crystallographic analysis of wild-type and mutant human TREM-2 ectodomains linked to neurodegenerative and inflammatory diseases. Protein Expr Purif. 96, 32-38 (2014).
- Yurtsever, Z., et al. Self-cleavage of human CLCA1 protein by a novel internal metalloprotease domain controls calcium-activated chloride channel activation. J Biol Chem. 287, 42138-42149 (2012).
- Sala-Rabanal, M., Yurtsever, Z., Nichols, C. G., Brett, T. J. Secreted CLCA1 modulates TMEM16A to activate Ca-dependent chloride currents in human cells. Elife. 4, (2015).
- Niesen, F. H., Berglund, H., Vedadi, M. The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability. Nat Protoc. 2, 2212-2221 (2007).
