Une expression efficace de cellules de mammifères et en une seule étape de purification extracellulaire glycoprotéines à la cristallisation
Summary
This is a quick, cost-efficient protocol for the production of secreted, glycosylated mammalian proteins and subsequent single-step purification with sufficient yields of homogenous protein for X-ray crystallography and other biophysical studies.
Abstract
Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time and cost efficient protocol for secreted protein expression in mammalian cells and one step purification using nickel affinity chromatography. The system is based on large scale transient transfection of mammalian cells in suspension, which greatly decreases the time to produce protein, as it eliminates steps, such as developing expression viruses or generating stable expressing cell lines. This protocol utilizes cheap transfection agents, which can be easily made by simple chemical modification, or moderately priced transfection agents, which increase yield through increased transfection efficiency and decreased cytotoxicity. Careful monitoring and maintaining of media glucose levels increases protein yield. Controlling the maturation of native glycans at the expression step increases the final yield of properly folded and functional mammalian proteins, which are ideal properties to pursue X-ray crystallography. In some cases, single step purification produces protein of sufficient purity for crystallization, which is demonstrated here as an example case.
Introduction
Comprendre la structure des protéines à un niveau atomique est clé pour découvrir la base moléculaire des voies biologiques et de maladies. X-ray cristallographie des protéines est la méthode la plus largement utilisée / applicable pour la détermination des structures macromoléculaires. Le principal défi de cette méthode est d'obtenir des quantités suffisantes de bien plié, protéine pure. Cela devient un problème particulier lorsque l'on travaille avec des protéines sécrétées mammifères, qui subissent des modifications post-traductionnelles spécifiques.
Protéines bactérienne exprimées sont la principale source de protéines cristallisées déposés dans la Protein Data Bank 1. Des systèmes d'expression bactériens sont largement préférés parce qu'ils sont rapides, peu coûteux et généralement produire des rendements élevés de protéine. Cependant, domaines extracellulaires des protéines de mammifère exprimées dans des bactéries sont souvent pas correctement repliés, dans ce cas, repliement et purification extensive étapes sont nécessaires pour obtenir de façon homogène foLDED protéines. En outre, de nombreuses protéines de mammifères exigent glycosylation post-traductionnelle pour atteindre un repliement approprié 2. Bien que l'expression et la glycosylation dans les cellules de levure ou d'insectes peuvent surmonter le problème de pliage, modifications post-traductionnelles, y compris la glycosylation, diffèrent considérablement de celles des cellules de mammifères 3, produisant des protéines avec des modifications incorrectes ou non-homogènes.
Les cellules de mammifères expriment toute la machinerie moléculaire nécessaire pour assurer modifications et pliage de post-traductionnelle appropriés; Toutefois, ces systèmes d'expression ne sont pas généralement préféré par la plupart des laboratoires, en raison de rendements limités et des coûts élevés de réactifs et de consommables. Polyéthylèneimine (PEI), un réactif de transfection norme est relativement pas cher mais impose cytotoxicité considérable et une faible efficacité de transfection, résultant en une augmentation des coûts dans les médias de la cellule, l'ADN, et de l'équipement en culture. Beaucoup de solutions de rechange aux PEI sont prohibitifs. Nous nous adressonsces questions en décrivant une combinaison de l'amélioration des outils de culture cellulaire et chimiquement modifiée PEI pour la méthode rapide et relativement peu coûteux pour l'expression de protéines de mammifères sécrétées, suivie d'une purification en une seule étape. Ce procédé donne des rendements suffisants robuste pour des études fonctionnelles et biochimiques 4, et dans certains cas, se traduit par une protéine se prêtent à une cristallisation sans autre purification.
Ce protocole décrit plusieurs techniques pour maximiser l'expression et le rendement pour les protéines de mammifères sécrété dans le rein embryonnaire humain (HEK) 293F cellules cultivées en suspension. L'efficacité de transfection (et le coût), la production et la purification de la protéine sont grandement améliorées tout en suivant le protocole. PEI modifié par l'addition de carbamates par réaction d'ouverture de cycle en une seule étape (PEI-TMC-25, synthèse et les propriétés décrites en détail dans la référence 5) améliore grandement l'efficacité de transfection, réduit la cytotoxicité de cationiquerupture de la membrane et par conséquent de réduire les coûts d'expérimentation. En outre, la viabilité des cellules et l'expression des protéines sont grandement améliorées grâce à l'ajout de compléments de culture à fournir du glucose et des vitamines. Il est important pour la production de protéines glycosylées, le traitement par la kifunensine, un inhibiteur chimique non-toxique de la mannosidase I, produit des protéines avec définis glycanes immatures, qui peuvent être éliminés par la EndoHf d'endoglycosidase pour produire des protéines avec un seul N-acétylglucosamine à la place du une pleine longueur glycane 6 N-liée. Enfin, la sécrétion de protéines dans un milieu défini chimiquement sans sérum permet une purification rapide et facile pour les études structurales et biochimiques. Single-step nickel-acide nitrilotriacétique de (Ni-NTA) purification de résine élimine la majorité des espèces contaminantes dans le surnageant et, dans certains cas, peut donner une protéine d'une pureté suffisante pour la cristallisation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cellules HEK 293F offrent une forte production de protéines nécessitant modifications post-traductionnelles. Ce système permet l'expression rapide et évolutive des protéines pliées contenant nativement disulfures, la glycosylation, la phosphorylation et qui, autrement, être absent en utilisant plus d'outils d'expression de routine. En outre, ce système peut être utilisé pour l'expression et la purification de complexes multi-protéines simplement par co-transfection de plusieurs plasmides. Outr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH R01-HL119813 (to T.J.B.), American Lung Association RG-196051 (to T.J.B.), a CIMED Pilot and Feasibility grant (to T.J.B.), American Heart Association Predoctoral Fellowships 14PRE19970008 (to Z.Y.) and 15PRE22110004 (to D.L.K.).
Materials
| Culture Flasks | GeneMate | F-5909B | |
| 293 Freestyle Media | Gibco/Life Technologies | 12338-018 | |
| GlutaMAX | Gibco/Life Technologies | 35050-061 | Use in place of Glutamine |
| Hype 5 transfection reagent | Oz Biosciences | HY01500 | |
| 293fectin transfection reagent | Life Technologies | 12347019 | |
| PEI transfection reagent | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| Maxiprep Kit | Qiagen | 12162 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 30430 | |
| Endo Hf | NEB | P0703L | |
| Amylose Resin | NEB | E8021S | |
| Cell Boost R05.2 | HyClone | SH30584.02 | Cell Culture Supplement |
| GlucCell | CESCO Bioengineering | DG2032 | Glucose Monitoring System |
| Opti-MEM | Life Technologies | 519850.91 | Serum Free Medium for DNA transfection |
| Luria Broth (LB Media) | Life Technologies | 10855-001 | |
| GC10 Competent Cells | Sigma-Aldrich | G2919 |
References
- Meyer, S., et al. Multi-host expression system for recombinant production of challenging proteins. PLoS One. 8, e68674 (2013).
- Chang, V. T., et al. Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem. Structure. 15, 267-273 (2007).
- Rich, J. R., Withers, S. G. Emerging methods for the production of homogeneous human glycoproteins. Nat Chem Biol. 5, 206-215 (2009).
- Wu, K., et al. TREM-2 promotes macrophage survival and lung disease after respiratory viral infection. J Exp Med. 212, 681-697 (2015).
- Yang, C., et al. Mitigated cytotoxicity and tremendously enhanced gene transfection efficiency of PEI through facile one-step carbamate modification. Adv Healthc Mater. 2, 1304-1308 (2013).
- Elbein, A. D. Glycosidase inhibitors: inhibitors of N-linked oligosaccharide processing. FASEB J. 5, 3055-3063 (1991).
- Aricescu, A. R., Lu, W., Jones, E. Y. A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62, 1243-1250 (2006).
- Kelker, M. S., Debler, E. W., Wilson, I. A. Crystal structure of mouse triggering receptor expressed on myeloid cells 1 (TREM-1) at 1.76 A. J Mol Biol. 344, 1175-1181 (2004).
- Kober, D. L., et al. Preparation, crystallization, and preliminary crystallographic analysis of wild-type and mutant human TREM-2 ectodomains linked to neurodegenerative and inflammatory diseases. Protein Expr Purif. 96, 32-38 (2014).
- Yurtsever, Z., et al. Self-cleavage of human CLCA1 protein by a novel internal metalloprotease domain controls calcium-activated chloride channel activation. J Biol Chem. 287, 42138-42149 (2012).
- Sala-Rabanal, M., Yurtsever, Z., Nichols, C. G., Brett, T. J. Secreted CLCA1 modulates TMEM16A to activate Ca-dependent chloride currents in human cells. Elife. 4, (2015).
- Niesen, F. H., Berglund, H., Vedadi, M. The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability. Nat Protoc. 2, 2212-2221 (2007).
