Effektiv Mammalian Cell Expression och Single-steg Rening av extracellulära glykoproteiner för kristallisation
Summary
This is a quick, cost-efficient protocol for the production of secreted, glycosylated mammalian proteins and subsequent single-step purification with sufficient yields of homogenous protein for X-ray crystallography and other biophysical studies.
Abstract
Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time and cost efficient protocol for secreted protein expression in mammalian cells and one step purification using nickel affinity chromatography. The system is based on large scale transient transfection of mammalian cells in suspension, which greatly decreases the time to produce protein, as it eliminates steps, such as developing expression viruses or generating stable expressing cell lines. This protocol utilizes cheap transfection agents, which can be easily made by simple chemical modification, or moderately priced transfection agents, which increase yield through increased transfection efficiency and decreased cytotoxicity. Careful monitoring and maintaining of media glucose levels increases protein yield. Controlling the maturation of native glycans at the expression step increases the final yield of properly folded and functional mammalian proteins, which are ideal properties to pursue X-ray crystallography. In some cases, single step purification produces protein of sufficient purity for crystallization, which is demonstrated here as an example case.
Introduction
Förstå proteinstruktur på atomnivå är nyckeln till att avslöja den molekylära grunden för biologiska vägar och sjukdomar. X-ray proteinkristallografi är den mest använda / användbar metod för bestämning av makromolekylära strukturer. Den största utmaningen med denna metod är att få tillräckliga mängder av ordentligt vikta, rent protein. Detta blir ett problem i synnerhet när man arbetar med utsöndrade däggdjursproteiner, vilka undergår specifika posttranslationella modifieringar.
Bakteriellt uttryckta proteiner är den primära källan för kristalliserade proteiner deponeras i Protein Data Bank 1. Bakteriella uttryckssystem är till stor del föredragna eftersom de är snabba, billiga och vanligen producera höga utbyten av protein. Emellertid extracellulära domänerna av däggdjursproteiner som uttrycks i bakterier är ofta inte korrekt veckad, i vilket fall återveckning och omfattande reningssteg krävs för att erhålla homogent folded proteinet. Dessutom har många däggdjursproteiner kräver posttranslationell glykosylering för att uppnå rätt vikning 2. Även uttryck och glykosylering i jäst eller insektsceller kan övervinna fällbara problemet, post-translationella modifieringar, inklusive glykosylering, skiljer sig markant från de däggdjursceller 3, vilket ger proteiner med felaktiga eller icke-homogena modifieringar.
Däggdjursceller uttrycker alla nödvändiga molekylära maskiner för att säkerställa korrekt posttranslationella modifieringar och vikning; emellertid är dessa expressionssystem inte typiskt föredras av de flesta laboratorium, på grund av begränsade utbyten och höga kostnader för reagenser och förbrukningsvaror. Polyetylenimin (PEI), är en standard transfektionsreagens relativt billiga men lägger stor cytotoxicitet och låg transfektionseffektivitet, vilket resulterar i ökade kostnader i cell media, DNA, och odling av utrustning. Många alternativ till PEI är oöverkomligt dyra. Vi vänder oss tilldessa frågor genom att beskriva en kombination av förbättrade cellodlingsverktyg och kemiskt modifierad PEI för snabb och relativt billig metod för expression av utsöndrade däggdjursproteiner, följt av ett steg rening. Denna robusta metod ger tillräcklig avkastning för funktionella och biokemiska studier 4, och i vissa fall resulterar i protein mottaglig för kristallisering utan ytterligare rening.
Detta protokoll beskriver flera tekniker för att maximera uttryck och ge för utsöndrade däggdjursproteiner i humana embryonala njur (HEK) 293F celler som odlas i suspension. Transfektionseffektivitet (och kostnad), proteinproduktion och rening är alla förbättras avsevärt genom att följa detta protokoll. PEI modifieras genom tillsats av karbamater genom ett enda steg ringöppningsreaktion (PEI-TMC-25, syntes och egenskaper beskrivs i detalj i ref 5) förbättrar avsevärt transfektionseffektivitet, minskar cytotoxiciteten från katjoniskamembran störningar och därmed minskar experimentkostnader. Vidare är cellviabiliteten och proteinuttryck förbättrats avsevärt med tillsats av odlingstillskott att leverera glukos och vitaminer. Viktigt för produktion av glykosylerade proteiner, behandling med kifunensine, en icke-giftig kemikalie hämmare av mannosidas I producerar proteiner med definierade, omogna glykaner, som kan avlägsnas genom endoglykosidas EndoHf att ge proteiner med en enda N-acetylglukosamin i stället för en fullängds N-kopplad glykan 6. Slutligen utsöndringen av proteiner till ett serumfritt, kemiskt definierat medium tillåter snabb och enkel rening för strukturella och biokemiska studier. Enda steg nickel nitrilotriättiksyra (Ni-NTA) harts rening avlägsnar huvuddelen av kontaminerande arter i supernatanten och, i vissa fall, kan ge proteinet med tillräcklig renhet för kristallisation.
Protocol
Representative Results
Discussion
HEK 293F-celler erbjuder robusta produktion av proteiner som kräver post-translationella modifieringar. Detta system möjliggör snabb och skalbar expression av nativt veckade proteiner innehållande disulfider, glykosylering och fosforylering, som annars skulle vara frånvarande användning mer rutinmässiga uttryck verktyg. Dessutom kan detta system användas för expression och rening av multiproteinkomplex att helt enkelt genom samtransfektion av multipla plasmider. Förutom TREM2 har detta system i stor utsträckn…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH R01-HL119813 (to T.J.B.), American Lung Association RG-196051 (to T.J.B.), a CIMED Pilot and Feasibility grant (to T.J.B.), American Heart Association Predoctoral Fellowships 14PRE19970008 (to Z.Y.) and 15PRE22110004 (to D.L.K.).
Materials
| Culture Flasks | GeneMate | F-5909B | |
| 293 Freestyle Media | Gibco/Life Technologies | 12338-018 | |
| GlutaMAX | Gibco/Life Technologies | 35050-061 | Use in place of Glutamine |
| Hype 5 transfection reagent | Oz Biosciences | HY01500 | |
| 293fectin transfection reagent | Life Technologies | 12347019 | |
| PEI transfection reagent | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| Maxiprep Kit | Qiagen | 12162 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 30430 | |
| Endo Hf | NEB | P0703L | |
| Amylose Resin | NEB | E8021S | |
| Cell Boost R05.2 | HyClone | SH30584.02 | Cell Culture Supplement |
| GlucCell | CESCO Bioengineering | DG2032 | Glucose Monitoring System |
| Opti-MEM | Life Technologies | 519850.91 | Serum Free Medium for DNA transfection |
| Luria Broth (LB Media) | Life Technologies | 10855-001 | |
| GC10 Competent Cells | Sigma-Aldrich | G2919 |
References
- Meyer, S., et al. Multi-host expression system for recombinant production of challenging proteins. PLoS One. 8, e68674 (2013).
- Chang, V. T., et al. Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem. Structure. 15, 267-273 (2007).
- Rich, J. R., Withers, S. G. Emerging methods for the production of homogeneous human glycoproteins. Nat Chem Biol. 5, 206-215 (2009).
- Wu, K., et al. TREM-2 promotes macrophage survival and lung disease after respiratory viral infection. J Exp Med. 212, 681-697 (2015).
- Yang, C., et al. Mitigated cytotoxicity and tremendously enhanced gene transfection efficiency of PEI through facile one-step carbamate modification. Adv Healthc Mater. 2, 1304-1308 (2013).
- Elbein, A. D. Glycosidase inhibitors: inhibitors of N-linked oligosaccharide processing. FASEB J. 5, 3055-3063 (1991).
- Aricescu, A. R., Lu, W., Jones, E. Y. A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62, 1243-1250 (2006).
- Kelker, M. S., Debler, E. W., Wilson, I. A. Crystal structure of mouse triggering receptor expressed on myeloid cells 1 (TREM-1) at 1.76 A. J Mol Biol. 344, 1175-1181 (2004).
- Kober, D. L., et al. Preparation, crystallization, and preliminary crystallographic analysis of wild-type and mutant human TREM-2 ectodomains linked to neurodegenerative and inflammatory diseases. Protein Expr Purif. 96, 32-38 (2014).
- Yurtsever, Z., et al. Self-cleavage of human CLCA1 protein by a novel internal metalloprotease domain controls calcium-activated chloride channel activation. J Biol Chem. 287, 42138-42149 (2012).
- Sala-Rabanal, M., Yurtsever, Z., Nichols, C. G., Brett, T. J. Secreted CLCA1 modulates TMEM16A to activate Ca-dependent chloride currents in human cells. Elife. 4, (2015).
- Niesen, F. H., Berglund, H., Vedadi, M. The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability. Nat Protoc. 2, 2212-2221 (2007).
