Verimli memeli hücre ekspresyon ve Kristalizasyon için hücre dışı Glikoproteinlerin Tek aşamalı saflaştırma
Summary
This is a quick, cost-efficient protocol for the production of secreted, glycosylated mammalian proteins and subsequent single-step purification with sufficient yields of homogenous protein for X-ray crystallography and other biophysical studies.
Abstract
Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time and cost efficient protocol for secreted protein expression in mammalian cells and one step purification using nickel affinity chromatography. The system is based on large scale transient transfection of mammalian cells in suspension, which greatly decreases the time to produce protein, as it eliminates steps, such as developing expression viruses or generating stable expressing cell lines. This protocol utilizes cheap transfection agents, which can be easily made by simple chemical modification, or moderately priced transfection agents, which increase yield through increased transfection efficiency and decreased cytotoxicity. Careful monitoring and maintaining of media glucose levels increases protein yield. Controlling the maturation of native glycans at the expression step increases the final yield of properly folded and functional mammalian proteins, which are ideal properties to pursue X-ray crystallography. In some cases, single step purification produces protein of sufficient purity for crystallization, which is demonstrated here as an example case.
Introduction
Atomik düzeyde protein yapısını anlamak biyolojik yollar ve hastalıkların moleküler temelini açığa çıkarmak için bir anahtardır. X-ışını protein kristalografisi makromoleküler yapıları belirlemek için en yaygın olarak kullanılan / uygulanabilir bir yöntemdir. Bu yöntemin en önemli sorun uygun bir şekilde katlanmış, saf protein yeterli miktarda elde edilmesidir. Bu durum, özellikle, belirli post-translasyonel modifikasyonlar maruz salgılanan memeli proteinlerinin birlikte çalışan bir sorun haline gelir.
Bakteriyel-ifade proteinler Protein Bilgi Bankası 1 yatırılır kristalize proteinlerin başlıca kaynağıdır. Bunların pahalı olmayan, hızlı ve tipik olarak proteinin yüksek verimlerinin üretilmesi için bakteriyel ekspresyon sistemleri büyük ölçüde tercih edilmektedir. Bununla birlikte, bakteriler içinde ifade edilen memeli proteinlerinin hücre dışı alanları genellikle düzgün fo homojen elde edilmesi için, bu durumda katlama ve kapsamlı saflaştırma adımları gereklidir katlanmış edilmezlded proteini. Ayrıca, birçok memeli proteinleri düzgün katlanmasına 2 elde etmek için post-translasyonel glikozilasyon gerektirir. Maya ya da böcek hücrelerinde ekspresyonu ve glikosilasyon katlama sorunun üstesinden de, glikosilasyon içeren post-translasyonel modifikasyonlar, yanlış ya da homojen olmayan modifikasyonlara sahip proteinlerin, sonuçta memeli hücreleri 3 kişilerce önemli ölçüde farklıdır.
Memeli hücreleri, uygun post-translasyonel modifikasyonları ve katlama sağlamak için gereken tüm moleküler yapıların ifade ederler; Bununla birlikte, bu ifade sistemleri tipik olarak, sınırlı miktarlarda ve reaktifler ve sarf maliyetlerinin yüksek, en çok laboratuarlar tarafından tercih edilmemektedir. Polietilenimin (PEI), standart transfeksiyon reaktifi nispeten ucuz ama önemli bir sitotoksisite ve düşük transfeksiyon verimi, hücre ortamı, DNA artan maliyeti ile sonuçlanır ve ekipman kültürlenmesi getirir. PEI Birçok alternatifler pahalıya bulunmaktadır. Biz elegeliştirilmiş hücre kültürü bir araç kombinasyonu tanımlama ve kimyasal olarak tek aşamalı saflaştırma ile salgılanan bir memeli proteinlerinin ifadesi için hızlı ve nispeten pahalı olmayan yöntemi için değiştirilmiş PEI, bu sorunlar. Bu sağlam bir yöntem, fonksiyonel ve biyokimyasal çalışmalar 4 için yeterli verim sağlar ve bazı durumlarda, daha fazla arıtılmadan kristalleştirme için uygun bir protein ile sonuçlanır.
Bu protokol ekspresyonunu maksimize etmek ve süspansiyon içinde yetiştirilmiş insan embriyonik böbrek (HEK) 'de salgılanmış proteinleri memeli hücreleri için 293F elde etmek için çeşitli teknikler tarif eder. Transfeksiyon verimliliği (ve maliyet), protein üretimi ve saflaştırılması tüm büyük ölçüde bu protokolü takip ederek geliştirilmiştir. Tek basamaklı halka açma reaksiyonu yoluyla karbamatlar eklenmesiyle tadil PEI (PEI-TMC-25, ref 5 ayrıntılı olarak tarif edilen sentez ve özellikleri) büyük ölçüde, transfeksiyon verimi iyileştirir katyonik gelen sitotoksisitesini azaltırbuna göre membran bozulması ve deney maliyetlerini azaltır. Bundan başka, hücre canlılığı ve protein ifadesi büyük ölçüde glukoz ve vitamin temin etmek için kültür takviyelerinin eklenmesiyle geliştirilmektedir. Önemli kifunensine ile glikosile proteinlerin, tedavi üretimi için, Manosidaz I'in bir toksik olmayan kimyasal inhibitörü yerine tek bir N-asetilglukosamin proteinleri üretmek üzere endoglikosidaz EndoHf çıkarılabilir tanımlanan, olgunlaşmamış glikanlar ile proteinler üretir Tam uzunlukta bir glikanın 6 N-bağlantılı. Son olarak, serumsuz, kimyasal olarak tanımlanmış ortam içine proteinleri salgılanmaktadır yapısal ve biyokimyasal çalışmalar için, hızlı ve kolay saflaştırılmasını sağlar. Tek aşamalı nikel nitrilotriasetik asit (Ni-NTA) reçinesi saflaştırma, bazı durumlarda, kristalizasyon için yeterli saflıkta bir proteini elde edilebilir, üstte kalan sıvı türlerin kirletici ve çoğunu çıkarır.
Protocol
Representative Results
Discussion
HEK 293F hücreleri post-translasyonel modifikasyonlar gerektiren proteinlerin üretimini sağlam sunuyoruz. Bu sistem disülfıdlere, glikosilasyon, aksi takdirde daha rutin ifade araçlarını kullanarak yokluğunda olacağını fosforilasyon içeren özgün katlanmış proteinlerin hızlı ve ölçeklenebilir bir ifade verir. Buna ek olarak, bu sistem, sadece birden fazla plazmidin birlikte transfeksiyonu ile ekspresyonu ve çoklu protein kompleksleri saflaştırılması için de kullanılabilir. TREM2 Bunun yanı s?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH R01-HL119813 (to T.J.B.), American Lung Association RG-196051 (to T.J.B.), a CIMED Pilot and Feasibility grant (to T.J.B.), American Heart Association Predoctoral Fellowships 14PRE19970008 (to Z.Y.) and 15PRE22110004 (to D.L.K.).
Materials
| Culture Flasks | GeneMate | F-5909B | |
| 293 Freestyle Media | Gibco/Life Technologies | 12338-018 | |
| GlutaMAX | Gibco/Life Technologies | 35050-061 | Use in place of Glutamine |
| Hype 5 transfection reagent | Oz Biosciences | HY01500 | |
| 293fectin transfection reagent | Life Technologies | 12347019 | |
| PEI transfection reagent | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| Maxiprep Kit | Qiagen | 12162 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 30430 | |
| Endo Hf | NEB | P0703L | |
| Amylose Resin | NEB | E8021S | |
| Cell Boost R05.2 | HyClone | SH30584.02 | Cell Culture Supplement |
| GlucCell | CESCO Bioengineering | DG2032 | Glucose Monitoring System |
| Opti-MEM | Life Technologies | 519850.91 | Serum Free Medium for DNA transfection |
| Luria Broth (LB Media) | Life Technologies | 10855-001 | |
| GC10 Competent Cells | Sigma-Aldrich | G2919 |
References
- Meyer, S., et al. Multi-host expression system for recombinant production of challenging proteins. PLoS One. 8, e68674 (2013).
- Chang, V. T., et al. Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem. Structure. 15, 267-273 (2007).
- Rich, J. R., Withers, S. G. Emerging methods for the production of homogeneous human glycoproteins. Nat Chem Biol. 5, 206-215 (2009).
- Wu, K., et al. TREM-2 promotes macrophage survival and lung disease after respiratory viral infection. J Exp Med. 212, 681-697 (2015).
- Yang, C., et al. Mitigated cytotoxicity and tremendously enhanced gene transfection efficiency of PEI through facile one-step carbamate modification. Adv Healthc Mater. 2, 1304-1308 (2013).
- Elbein, A. D. Glycosidase inhibitors: inhibitors of N-linked oligosaccharide processing. FASEB J. 5, 3055-3063 (1991).
- Aricescu, A. R., Lu, W., Jones, E. Y. A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62, 1243-1250 (2006).
- Kelker, M. S., Debler, E. W., Wilson, I. A. Crystal structure of mouse triggering receptor expressed on myeloid cells 1 (TREM-1) at 1.76 A. J Mol Biol. 344, 1175-1181 (2004).
- Kober, D. L., et al. Preparation, crystallization, and preliminary crystallographic analysis of wild-type and mutant human TREM-2 ectodomains linked to neurodegenerative and inflammatory diseases. Protein Expr Purif. 96, 32-38 (2014).
- Yurtsever, Z., et al. Self-cleavage of human CLCA1 protein by a novel internal metalloprotease domain controls calcium-activated chloride channel activation. J Biol Chem. 287, 42138-42149 (2012).
- Sala-Rabanal, M., Yurtsever, Z., Nichols, C. G., Brett, T. J. Secreted CLCA1 modulates TMEM16A to activate Ca-dependent chloride currents in human cells. Elife. 4, (2015).
- Niesen, F. H., Berglund, H., Vedadi, M. The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability. Nat Protoc. 2, 2212-2221 (2007).
