Bericht Column Derivatisering behulp Reaction Flow High Performance Liquid Chromatography Columns

Summary

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented.

Abstract

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented. A major difficulty in adapting PCD to modern HPLC systems and columns is the need for large volume reaction coils that enable reagent mixing and then the derivatization reaction to take place. This large post column dead volume leads to band broadening, which results in a loss of observed separation efficiency and indeed detection in sensitivity. In reaction flow post column derivatization (RF-PCD) the derivatization reagent(s) are pumped against the flow of mobile phase into either one or two of the outer ports of the reaction flow column where it is mixed with column effluent inside a frit housed within the column end fitting. This technique allows for more efficient mixing of the column effluent and derivatization reagent(s) meaning that the volume of the reaction loops can be minimized or even eliminated altogether. It has been found that RF-PCD methods perform better than conventional PCD methods in terms of observed separation efficiency and signal to noise ratio. A further advantage of RF-PCD techniques is the ability to monitor effluent coming from the central port in its underivatized state. RF-PCD has currently been trialed on a relatively small range of post column reactions, however, there is currently no reason to suggest that RF-PCD could not be adapted to any existing one or two component (as long as both reagents are added at the same time) post column derivatization reaction.

Introduction

High performance liquid chromatografie (HPLC) in combinatie met post column derivatisering (PCD) is een krachtige tool die nuttig zijn bij het oplossen van een aantal zaken in het analytisch laboratorium is. Het kan worden gebruikt om verbindingen die anders ondetecteerbaar de reeks detectoren verkrijgbaar zijn ^1,2 detecteren, verhogen het signaal van het doelanalyt, waarbij ondergrenzen van detectie en kwantificering ^3-5 toelaat of selectief derivatiseren een doelanalyt ter voorkoming matrixeffecten ^6. Algemeen gebruikte PCD reacties omvatten de omzetting van amines, zoals aminozuren, met ortho-phthaladehyde ^7-9, ninhydrine ^9,10 of ^11,12 fluorescamine, de derivatisering van reactieve zuurstofsoorten (ROS) met de 2,2-difenyl- 1-picrylhydrazil groep (DPPH ^{•) 13,14} of 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonzuur (ABTS) ^15,16 en het gebruik van de jodide-azide reagens zwavel c derivatiserenontaining verbindingen ^17,18.

Er zijn echter vele nadelen aan het gebruik van PCD reacties met HPLC systemen ^6. Voornamelijk hiervan is het gebruik van spoelen reactie tussen het punt van toevoeging van het derivatiseringsreagens (s) en de detector, welke tijd mogelijk maken voor het mengen en de reactie plaatsvinden ^8. Deze reactie lussen vaak volumes van 500 ul of meer, die significant in vergelijking met het volume van de rest van het HPLC-systeem ^19. Het gebruik van deze hoge reactievolume lussen resulteert in verhoogde piekverbreding vergeleken met wat zou worden waargenomen zonder de aanwezigheid van de reactielus. Dit resulteert in kortere, bredere pieken die hoger kwantificeringsgrenzen en detectie hebben en negatief beïnvloedt chromatografische resolutie. Figuren 1 en 2 benadrukken de verslechtering van piekvorm die resulteren uit de toevoeging van verschillende postkolom reactielus volumes. deze analysewerd uitgevoerd met een mobiele fase mengsel van 94% methanol en 6% Milli-Q water. De stroomsnelheid van de mobiele fase was 1 ml / min, het injectievolume was 20 ui en de golflengte analyse was 265 nm. Spoelen van verschillende dode volume van 20 pl tot 1000 ul werden ingevoegd tussen de kolom en de detector om de effecten van reactielus dood volume in PCD werkwijzen simuleren. Deze lussen werden uit roestvrij stalen buis van 0,5 mm inwendige diameter. Het experiment werd uitgevoerd op een HPLC-systeem dat bestaat uit een regelaar (SCL-10AVP), een lage druk Gradient klep (FCL-10ALVP), een pomp (LC-20AD), een injector (SIL-10ADVP), en een PDA detector ( SPD-M10ADVP). De mobiele fase werd door een ontgasser gepompt voorafgaand aan het inbrengen in het HPLC-systeem. De scheiding werd uitgevoerd met een 250 mm x 4,6 mm ID kolom 5 urn. Proefomstandigheden werden gekozen typisch PCD reacties die onlangs in de literatuur bekend zijn.

Deeenvoudigste, het meest voorkomende postkolom reactor opstelling wordt aangeduid als een niet-gesegmenteerde buisvormige reactor die in feite een lange, dunne buis waardoor de vloeistof kan stromen en de reactie kan plaatsvinden. In dit systeem piekverbreding is afhankelijk niet alleen het dode volume toegevoegd aan het systeem, maar ook de inwendige diameter van de buis zoals door Iijima et al. ^8. Bovendien spoelgeometrie een rol speelt bij de waargenomen merk verbreding. Stewart ²⁰ verklaard dat het wikkelen van de reactor verandert de secundaire stroom profielen, wat resulteert in betere menging, waardoor het dode volume geminimaliseerd worden. Men heeft gezegd dat de piek verbreding niet significant is bij het ​​gebruik van een open rond gebreide spoel ^21. Wanneer de piekverbreding overmatig groot, kunnen andere soorten reactoren ook worden overwogen ^20,22. Deze kunnen onder meer bed reactoren of gesegmenteerde stroom reactoren. Deze reactoren zijn in het bijzonder bruikbaar voor langzame reacties die anders require grote reactie loops. Als niet-gesegmenteerde buisvormige reactoren zijn de meest voorkomende soorten reactoren worden gebruikt in PCD-toepassingen, de rest van dit artikel gaat met dit type reactor setup.

Het ontwerp van de reactiekolom stroom (RF) omvat een multi-poort eindfitting waarmee mobiele fase om de kolom af te sluiten (of voer) met een enkele poort aan het radiale centrale gebied van de kolom of drie poorten aan de buitenste wandgebied van de kolom (zie figuur 3). Beide stromen worden gescheiden onder toepassing van een eindfitting die een centrale poreuze frit die wordt omgeven door een ondoordringbare ring die op zijn beurt omgeven door een buitenste poreuze frit die zich uitstrekt naar de kolomwand. Door de centrale ondoordringbare ring dwarsstroom niet tussen de twee poreuze gebieden.

Tijdens de reactie stroom chromatografie, worden de derivatiseringsreagens (s) tegen de richting van de mobiele fasestroom gepompt in een of two van de buitenste poorten van de reactiekolom stroom. De kolom eluent wordt gemengd met het derivatiseringsreagens (s) in de buitenste frit en doorgegeven aan de detector via een buitenmantel poort. Reactie stroom kan worden gebruikt voor een enkele reagens derivatisering (1 poort voor het derivatiseringsreagens, 1 poort naar de kolom eluent doorgeven aan de detector en 1 poort geblokkeerd) of een dubbele reagenssysteem (2 poorten voor de derivatisering reagentia en 1 poort langs de kolom elutiemiddel waardoor de detector). De stroom uit de centrale stroom kan worden gebruikt om de gederivatiseerde kolom eluent effectief multiplexing detectie ^23, of doorgegeven aan afval detecteren.

Een belangrijke tuning techniek die beschikbaar is bij het uitvoeren van RF-PCD chromatografie is de verhouding tussen de centrale en perifere stromen. De optimale verhouding voor elke derivatisering afhankelijk van een aantal factoren als de centrale stroom wordt gedetecteerd of doorgegeven aan afval. Derhalve opnieuw de optimale verhouding is vastgesteld, Moet ervoor worden gezorgd dat de juiste stroom verhouding voorafgaand aan elke run wordt uitgevoerd wordt bereikt.

Gebleken is dat het gebruik van een frit op de kolom eluent stroom en derivatiseringsreagens RF-PCD leidt tot meer efficiënte menging in vergelijking met traditionele mengtechnieken die gebruiken typisch een dood volume nul T-stuk of klein dood volume meng W- piece de twee stromen te mengen. Dit heeft het gebruik van relatief kleine lussen reactie, of zelfs de eliminatie van de reactielus geheel. De vermindering van de reactielus formaat leidt tot scherpere pieken in vergelijking met traditionele postkolom derivatisering methoden. Dit betekent dat, hoewel niet alle van de kolom eluent gederivatiseerd, grotere signaal-ruisverhoudingen worden waargenomen en dus lagere detectiegrenzen en kwantificatie worden verkregen.

Reactie stroom chromatografie ontwikkeld om problemen met de aanpassing van PCD reactie overwinnens moderne HPLC kolommen en systemen, met name het rendementsverlies door bandverbreding door grote postkolom dode ruimten als gevolg van de noodzaak om gebruik grote reactievolume lussen. Hoe efficiënter mengprocessen in RF-PCD vergelijking met conventionele PCD dat kleinere reactielus volume worden gebruikt leidt tot een toename waargenomen scheidingsefficiëntie. Verder RF-PCD chromatografie toont beide verhoogd signaal en verminderde ruis in vergelijking met conventionele technieken PCD resulteert in lagere grenzen van de detectie en kwantificering in vergelijking met conventionele methoden PCD. Een bijkomend voordeel van RF-PCD PCD vergelijking met conventionele werkwijzen is de mogelijkheid om de gederivatiseerde stroom die elueert uit de centrale poort van de RF kolom en het gederivatiseerde stroom die elueert uit het omtreksgebied van de kolom te volgen. RF-PCD is een relatief nieuwe, maar veelbelovende techniek die veel voordelen ten opzichte van traditionele methoden PCD weergeeft.

<p class="jove_content"> Verbinding van de RF kolom wordt bereikt bijna dezelfde wijze als een gebruikelijke HPLC-kolom met als belangrijkste verschil het aantal eindfittingen een RF kolom. Fittingen gebruikt om een ​​standaard HPLC-kolom HPLC systeem verbinding kunnen worden gebruikt om een ​​RF kolom sluiten op het HPLC systeem.

Protocol

Let op: Raadpleeg de veiligheidsinformatiebladen (VIB) voor alle materialen en reagentia voor het gebruik (dwz, VIB voor methanol). Zorg ervoor dat het gebruik van alle nodige veiligheidsvoorschriften bij de omgang met oplosmiddelen en High Performance Liquid Chromatography (HPLC) eluent. Zorgen voor het juiste gebruik van technische controles van HPLC, analytische balans en de detector instrumentatie, en zorgen voor het gebruik van persoonlijke beschermingsmiddelen (veiligheidsbril, handschoenen, laboratoriumjas, volledige lengte …

Representative Results

De eerste PCD methode die werd aangepast voor RF-PCD is de derivatisering van antioxidanten met de 2,2-difenyl-1-picrylhydrazil groep (DPPH •) 24. Deze reactie werd geïntroduceerd door Koleva et al. 25 en is op grote schaal gebruikt sinds. De detectie is gebaseerd op de ontkleuring van de DPPH • radicalen in aanwezigheid van reactieve zuurstofspecies, vandaar de aanwezigheid van antioxidanten leidt tot een daling van de absorptie waargenomen. De DPPH •</su…

Discussion

RF-PCD maakt het efficiënt mengen van het derivatiseringsreagens het effluent na de kolom HPLC zonder gebruik van reactie spoelen, het minimaliseren van de effecten van bandverbreding en verbetering scheidend vermogen. RF-PCD werkwijzen hebben ook aangetoond verbeterd signaal respons met betrekking tot detectie methode. Camenzuli et al. ²⁸ was de eerste die de toepassing van reactie stroom kolommen met DPPH ^• voor de detectie van ROS in een espresso monster melden. Hun studie omvatte de…

Materials

HPLC instrument	Agilent	1290 Series HPLC
Additional Pump(s) for derivatisation system	Shimadzu	LC-20A
RF colum			Non-commercial
PEEK tubing	Sigma Aldrich	Z227307
Column stoppers			Provided with column
PEEK tube cutter	Sigma Aldrich	Z290882
Analytical Scale Balance			4-point analytical balance
Stop watch			Non-Scientific equiptment
Eluent collection vials			Any Small vial with a flat bottom will do e.g. HPLC vials
HPLC Vials			Will depend on instrument used
Vessels for mobile phase and derivatisation solution(s)	Sigma Aldrich	Z232211
General Laboratory glassware			Volumetric Flasks, pippettes, etc. Quantity and volumes will depend on sample preparation method
Methanol	Sigma Aldrich	34860
DPPH	Sigma Aldrich	D9132
Ammonium Acetate	Sigma Aldrich	17836
Ammonia	Sigma Aldrich	320145	Corrosive
Acetonitrile	Sigma Aldrich	34998
Fluorescamine	Sigma Aldrich	F9015
4-aminoantipyrene	Acros Organics BVBA	AC103151000
Potassium ferricyanide	AnalaR	B10204-30