Poster Colonne dérivatisation en utilisant la réaction Colonnes flux chromatographie liquide haute performance

Summary

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented.

Abstract

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented. A major difficulty in adapting PCD to modern HPLC systems and columns is the need for large volume reaction coils that enable reagent mixing and then the derivatization reaction to take place. This large post column dead volume leads to band broadening, which results in a loss of observed separation efficiency and indeed detection in sensitivity. In reaction flow post column derivatization (RF-PCD) the derivatization reagent(s) are pumped against the flow of mobile phase into either one or two of the outer ports of the reaction flow column where it is mixed with column effluent inside a frit housed within the column end fitting. This technique allows for more efficient mixing of the column effluent and derivatization reagent(s) meaning that the volume of the reaction loops can be minimized or even eliminated altogether. It has been found that RF-PCD methods perform better than conventional PCD methods in terms of observed separation efficiency and signal to noise ratio. A further advantage of RF-PCD techniques is the ability to monitor effluent coming from the central port in its underivatized state. RF-PCD has currently been trialed on a relatively small range of post column reactions, however, there is currently no reason to suggest that RF-PCD could not be adapted to any existing one or two component (as long as both reagents are added at the same time) post column derivatization reaction.

Introduction

Chromatographie haute performance liquide (HPLC) couplée à la colonne après dérivatisation (PCD) est un outil puissant qui est utile dans la résolution d'un certain nombre de questions dans le laboratoire d'analyse. Il peut être utilisé pour détecter des composés qui sont par ailleurs indétectable à la série de détecteurs disponibles ^1,2, augmenter le signal de l'analyte cible, ce qui permet aux limites inférieures de détection et la quantification ou de manière sélective ^05/03 dérivatiser un analyte cible, afin d'éviter les effets de matrice ^6. Les réactions PCD couramment utilisés comprennent la réaction des amines, telles que des acides aminés, avec l' ortho-phthaladehyde ^7-9, ou ninhydrine ^{9,10 11,12} fluorescamine, la dérivatisation d'espèces réactives de l' oxygène (ERO) avec le 2,2-diphényl 1-picrylhydrazil radicaux DPPH ^(•) ou ^13,14 2,2'-azino-bis (acide 3-éthylbenzothiazoline-6-sulfonique (ABTS) ^15,16, et l'utilisation du réactif iodure azoture pour dériver du soufre ccomposés ontenant ^17,18.

Il existe, cependant, de nombreux inconvénients à l'utilisation de réactions de PCD avec des systèmes HPLC ^6. Parmi ceux – ci principalement l'utilisation de bobines de réaction entre le point d'addition du réactif de dérivatisation (s) et le détecteur, ce qui permet le temps de mélange et la réaction se produise ^8. Ces réactions boucles ont souvent des volumes de 500 ul ou plus, ce qui est important par rapport au volume du reste du système HPLC ^19. L'utilisation de ces réactions à volume élevé entraîne une augmentation de boucles élargissement du pic par rapport à celle qui serait observée en l'absence de la boucle de réaction. Il en résulte, des pics plus courts plus larges qui ont des limites plus élevées de quantification et de détection et négativement effets que la résolution chromatographique. Les figures 1 et 2 mettre en évidence la détérioration de la forme des pics qui résultent de l'addition de divers volumes de boucle de réaction post-colonne. cette analysea été réalisée avec une composition de phase mobile de 94% de methanol et de 6% d'eau Milli-Q. Le débit de la phase mobile d'écoulement était de 1 ml / min, le volume d'injection était de 20 ul et l'analyse de la longueur d'onde est de 265 nm. Des bobines de faire varier les volumes morts de 20 pi à 1000 pi ont été insérées entre la colonne et le détecteur pour simuler les effets de la boucle de réaction un volume mort dans les procédés de PCD. Ces boucles ont été préparés à partir d'un tube de diamètre intérieur 0,5 mm en acier inoxydable. L'expérience a été effectuée sur un système HPLC constitué d'un dispositif de commande (SCL-10Avp), un faible gradient de pression de soupape (LCM-10ALVP), une pompe (LC-20ad), un injecteur (SIL-10ADVP), et un détecteur (PDA SPD-M10ADVP). La phase mobile est pompée à travers un dégazeur avant l'introduction dans le système HPLC. La séparation a été effectuée en utilisant un x 4,6 mm id 5 um colonne de 250 mm. Les conditions expérimentales ont été choisies pour être typique de réactions PCD qui ont récemment été publiés dans la littérature.

lela plus simple, la configuration du réacteur à colonne de poste le plus commun est appelé un réacteur tubulaire non segmenté qui est effectivement un long tube mince à travers lequel le liquide peut couler et la réaction peut avoir lieu. Dans ce pic système élargissement dépend non seulement sur ​​le volume mort ajouté au système, mais aussi le diamètre intérieur du tube , comme mis en évidence par Iijima et al. , ^8. En outre, la géométrie de la bobine joue un rôle dans la marque élargissement observée. Stewart a indiqué que ²⁰ l' enroulement du réacteur modifie les profils d'écoulement secondaire, ce qui entraîne un meilleur mélange, ce qui signifie que le volume mort peut être réduite au minimum. Il a été déclaré que l' élargissement des pics est pas significative lors de l' utilisation d' un tube ouvert tricoté bobine ^21. Lors de l'élargissement du pic est trop grande, d' autres types de réacteurs peuvent également être considérés ^20,22. Ceux-ci peuvent comprendre des réacteurs à lit ou réacteurs à écoulement segmenté. Ces réacteurs sont particulièrement utiles pour des réactions lentes qui seraient autrement require grande réaction des boucles. Comme réacteurs tubulaires non-segmentés sont les types les plus courants de réacteurs utilisés dans les applications PCD, le reste de cet article traite de ce type de configuration du réacteur.

La conception de la colonne d'écoulement de réaction (RF) comprend un raccord d'extrémité à orifices multiples qui permet la phase mobile pour sortir (ou entrée) de la colonne à travers un seul port situé dans la zone centrale radiale de la colonne ou trois ports situés à l'extérieur région de paroi de la colonne (voir figure 3). Ces deux courants sont séparés au moyen d'un raccord d'extrémité contenant une fritte poreuse centrale qui est entourée par un anneau imperméable qui est à son tour entourée par une fritte poreuse externe qui se prolonge vers la paroi de la colonne. En raison de l'écoulement imperméable bague de croix centrale est pas possible entre les deux régions poreuses.

Au cours de la Chromatographie d'écoulement de réaction, le réactif (s) de dérivation sont pompés à l'encontre du sens d'écoulement de la phase mobile dans une ou two des orifices extérieurs de la colonne d'écoulement de réaction. L'éluant de la colonne est mélangée avec le réactif (s) de dérivatisation dans la fritte externe et transmis au détecteur à travers un orifice externe libre. écoulement de réaction peut être utilisé soit pour un dérivé réactif unique (1 port du réactif de dérivatisation, 1 port pour passer l'éluant de la colonne au détecteur et 1 port bloqué) ou d'un système réactif à deux (2 ports pour les réactifs de dérivatisation et 1 port passer la colonne éluant au détecteur). Le débit du courant central peut soit être utilisé pour détecter l'éluant de la colonne dérivatisé, la détection efficace de multiplexage ^23, ou passé à perdre.

Une technique de réglage principal qui est disponible lors de l'exécution chromatographie RF-CPD est le rapport entre les flux centraux et périphériques. Le rapport optimal pour chaque dérivatisation dépend d'un certain nombre de facteurs, tels que l'écoulement central sera détecté ou transmis à déchets. Par conséquent, une fois que le rapport optimal a été déterminé, Il faut veiller à ce que le rapport de débit correct est réalisé avant chaque exécution en cours d'exécution.

Il a été constaté que l'utilisation d'une fritte pour mélanger le courant colonne d'éluant et le réactif de dérivatisation dans les résultats RF-CPD dans un mélange plus efficace par rapport à des techniques de mélange classiques qui emploient typiquement une pièce en T à zéro du volume mort ou de faible volume mort W- pièce à mélanger les deux courants. Ceci a permis l'utilisation de relativement petites boucles de réaction, voire la suppression de la boucle de réaction au total. La diminution des résultats de la taille de réaction en boucle pics plus par rapport aux méthodes traditionnelles de dérivatisation post-colonne. Cela signifie que, en dépit du fait que la totalité de l'éluant de la colonne est dérivatisé, un plus grand rapport signal sur bruit sont observés et donc des limites inférieures de détection et la quantification peut être réalisée.

Chromatographie d'écoulement de réaction a été mis au point pour surmonter les difficultés d'adaptation de la réaction de CPDs aux colonnes modernes de CLHP et de systèmes, en particulier la perte d'efficacité causée par l'élargissement de bande en raison de grands volumes morts après des colonnes causées par la nécessité d'employer la réaction de grand volume boucles. Les procédés de mélange plus efficaces RF-PCD PCD par rapport au conventionnel signifie que le volume de la boucle de réaction inférieures peuvent être employées conduisant à une augmentation de l'efficacité de la séparation observée. Par ailleurs Chromatographie RF-PCD montre à la fois le signal augmenté et diminué de bruit par rapport aux techniques de PCD classiques aboutissant à des limites inférieures de détection et la quantification par rapport aux méthodes de PCD classiques. Un autre avantage de la CPD-RF par rapport aux méthodes classiques de la CPD est la capacité à surveiller le courant dérivatisé qui est élué à partir de l'orifice central de la colonne HF ainsi que le courant dérivé qui est élué à partir de la région périphérique de la colonne. RF-PCD est relativement nouvelle mais prometteuse technique qui affiche de nombreux avantages par rapport aux méthodes traditionnelles de PCD.

<p class="jove_content"> Connexion de la colonne HF est réalisée pratiquement de la même manière qu'une colonne de HPLC classique avec la différence majeure étant le nombre de raccords d'extrémité sur une colonne RF. Les raccords utilisés pour connecter une colonne de HPLC standard pour le système HPLC peuvent être utilisés pour connecter une colonne RF au système HPLC.

Protocol

Attention: S'il vous plaît se référer à des fiches de données de sécurité (FDS) pour tous les matériaux et réactifs avant utilisation (c. -à- FS pour le méthanol). Assurer l'utilisation de toutes les pratiques de sécurité appropriées lors de la manipulation des solvants et chromatographie liquide haute performance (HPLC) éluant. Veiller à l'utilisation appropriée des contrôles techniques de HPLC analytique équilibre et détecteur instrumentation, et d'assurer l'utilisation des équipements de …

Representative Results

La première méthode PCD qui a été adapté pour être utilisé par RF-PCD est la dérivatisation d'antioxydants en utilisant le radical 2,2-diphényl-1-picrylhydrazil (DPPH •) 24. Cette réaction a été introduit par Koleva et al. , 25 et a été largement utilisée depuis. La détection repose sur la décoloration du DPPH • radicalaire en présence d'espèces réactives de l' oxygène, d' où la présence d'anti – oxydants se traduit par u…

Discussion

RF-PCD permet le mélange efficace du réactif de dérivatisation avec le post-colonne HPLC effluent sans l'utilisation de bobines de réaction, minimisant ainsi les effets de l'élargissement de bande et améliorer la performance de séparation. Méthodes RF-CPD ont également montré l'amélioration de la réponse du signal par rapport au procédé de détection. Camenzuli et al. ²⁸ a été le premier à signaler l'utilisation de colonnes de flux de réaction avec DPPH ^•</sup…

Materials

HPLC instrument	Agilent	1290 Series HPLC
Additional Pump(s) for derivatisation system	Shimadzu	LC-20A
RF colum			Non-commercial
PEEK tubing	Sigma Aldrich	Z227307
Column stoppers			Provided with column
PEEK tube cutter	Sigma Aldrich	Z290882
Analytical Scale Balance			4-point analytical balance
Stop watch			Non-Scientific equiptment
Eluent collection vials			Any Small vial with a flat bottom will do e.g. HPLC vials
HPLC Vials			Will depend on instrument used
Vessels for mobile phase and derivatisation solution(s)	Sigma Aldrich	Z232211
General Laboratory glassware			Volumetric Flasks, pippettes, etc. Quantity and volumes will depend on sample preparation method
Methanol	Sigma Aldrich	34860
DPPH	Sigma Aldrich	D9132
Ammonium Acetate	Sigma Aldrich	17836
Ammonia	Sigma Aldrich	320145	Corrosive
Acetonitrile	Sigma Aldrich	34998
Fluorescamine	Sigma Aldrich	F9015
4-aminoantipyrene	Acros Organics BVBA	AC103151000
Potassium ferricyanide	AnalaR	B10204-30