Post Kolumn Derivatisering Använda reaktionsflödes High Performance Liquid Chromatography Columns

Summary

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented.

Abstract

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented. A major difficulty in adapting PCD to modern HPLC systems and columns is the need for large volume reaction coils that enable reagent mixing and then the derivatization reaction to take place. This large post column dead volume leads to band broadening, which results in a loss of observed separation efficiency and indeed detection in sensitivity. In reaction flow post column derivatization (RF-PCD) the derivatization reagent(s) are pumped against the flow of mobile phase into either one or two of the outer ports of the reaction flow column where it is mixed with column effluent inside a frit housed within the column end fitting. This technique allows for more efficient mixing of the column effluent and derivatization reagent(s) meaning that the volume of the reaction loops can be minimized or even eliminated altogether. It has been found that RF-PCD methods perform better than conventional PCD methods in terms of observed separation efficiency and signal to noise ratio. A further advantage of RF-PCD techniques is the ability to monitor effluent coming from the central port in its underivatized state. RF-PCD has currently been trialed on a relatively small range of post column reactions, however, there is currently no reason to suggest that RF-PCD could not be adapted to any existing one or two component (as long as both reagents are added at the same time) post column derivatization reaction.

Introduction

Högpresterande vätskekromatografi (HPLC) i kombination med efterkolonn derivatisering (PCD) är ett kraftfullt verktyg som är användbar för att lösa ett antal frågor i analyslaboratoriet. Det kan användas för att detektera föreningar som annars är omöjlig att upptäcka med suite av detektorer tillgängliga ^1,2, öka signal av målanalyten, som tillåter lägre gränser för detektering och kvantifiering ^3-5 eller selektivt derivatisera en målanalyt i syfte att undvika matriseffekter ^6. Vanligen använda PCD reaktioner innefattar reaktionen av aminer, såsom aminosyror, med orto-phthaladehyde ^7-9, ninhydrin ^9,10 eller fluorescamin ^11,12, derivatiseringen av reaktiva syreradikaler (ROS) med 2,2-difenyl- 1-picrylhydrazil radikala (DPPH ^{•) 13,14} eller 2,2'-azino-bis (3-etylbensotiazolin-6-sulfonsyra (ABTS) ^15,16, och användningen av jodiden-azid-reagens för att derivatisera svavel containing föreningar ^17,18.

Det finns emellertid flera nackdelar med användningen av PCD-reaktioner med HPLC-system ^6. Huvudsakligen bland dessa är användningen av reaktionsspolar mellan punkten för tillsats av derivatisering reagens (er) och detektorn, vilket medger tid för blandning och att reaktionen ska ske ^8. Dessa reaktion slingor ofta har volymer av 500 l eller mer, vilket är signifikant jämfört med volymen av resten av HPLC-systemet ^19. Användningen av dessa stora volymer reaktions slingor resulterar i ökad toppbreddning jämfört med vad som skulle observeras utan närvaro av reaktionsslingan. Detta resulterar i kortare, bredare toppar som har högre gränser för kvantifiering och detektion och negativt påverkar kromatografiska upplösning. Figurerna 1 och 2 belysa försämringen av topp form som resulterar från tillsatsen av olika postkolonnreaktion loop volymer. denna analysutfördes med en mobil fas sammansättning 94% metanol och 6% Milli-Q-vatten. Flödeshastigheten för den mobila fasen var 1 ml / min, injektionsvolymen var 20 | il och analysen våglängden var 265 nm. Spolar av varierande dödvolymer från 20 ^ till 1000 pl infördes mellan kolonnen och detektorn för att simulera effekterna av reaktionsslinga dödvolym i PCD metoder. Dessa slingor framställdes från slang av rostfritt stål på 0,5 mm innerdiameter. Experimentet utfördes på en HPLC-system bestående av en styrenhet (SCL-10AVP), en Low Pressure Gradient Ventil (FCL-10ALVP), en pump (LC-20AD), en injektor (SIL-10ADVP), och en PDA-detektor ( SPD-M10ADVP). Den mobila fasen pumpades genom en avgas före införandet i HPLC-systemet. Separationen utfördes med användning av en 250 mm x 4,6 mm id 5 ^ m kolonn. Experimentella betingelser valdes för att vara typiska för PCD reaktioner som nyligen har publicerats i litteraturen.

Deenklaste, är vanligast efterkolonnreaktor inställnings benämns en icke-segmenterad rörformig reaktor, som är effektivt en lång, tunn slang genom vilken vätskan kan strömma och reaktionen kan äga rum. I detta system toppbreddning är beroende av inte bara den döda volymen sattes till systemet, utan också den inre diametern hos röret som belysts av Iijima et al. ^8. Dessutom spelar spole geometri en del i den observerade varumärkesbreddning. Stewart ²⁰ uppgav att linda av reaktorn ändrar de sekundära flödesprofiler, vilket resulterar i bättre blandning, vilket innebär att dödvolymen kan minimeras. Det har sagts att toppbreddning är inte signifikant vid användning av en öppen rundstickad spolen ^21. När toppbreddning är överdrivet stor, kan andra typer av reaktorer också övervägas ^20,22. Dessa kan inkludera bäddsreaktorer eller segmenterade flödesreaktorer. Dessa reaktorer är särskilt användbara för långsamma reaktioner som annars require stor reaktion loopar. Som icke-segmenterade rörformiga reaktorer är de vanligaste typerna av reaktorer som används i PCD-program, resten av denna artikel handlar om denna typ av reaktor setup.

Utformningen av kolonnen reaktionsflödet (RF) innefattar ett med flera portar ändbeslag som tillåter mobil fas för att avsluta (eller enter) kolonnen genom antingen en enda port placerad vid den radiella mittområdet av kolonnen eller tre portar belägna vid den yttre väggområde av kolonnen (se figur 3). Dessa två strömmar är separerade med användning av en ändanslutning som innehåller en central porös fritta som är omgiven av ett ogenomträngligt ring som är i sin tur omgiven av en yttre porös fritta, som sträcker sig ut till kolonnväggen. Tack vare det centrala ogenomträngliga ringen tvärflöde är inte möjlig mellan de två porösa regioner.

Under reaktionsflödes kromatografi är derivatiseringen reagens (s) pumpas mot riktningen för mobilflödes fas i en eller two av de yttre hamnar i kolumn reaktionsflödet. Kolonneluenten blandas med derivatisering reagens (er) i den yttre fritta och ledes till detektorn genom en fri ytterport. Reaktionsflödes kan användas för antingen en enda reagens derivatisering (en port för derivatisering reagens, till en port passera kolonnen elueringsmedel till detektorn och en port blockerade) eller ett dubbelt reagenssystem (2 portar för derivatiseringen reagens och en port för att passera kolonnen elueringsmedel till detektorn). Flödet från den centrala strömmen kan antingen användas för att detektera oderivatiserade Kolonneluenten effektivt multiplexering upptäckt ^23, eller gått till spillo.

En stor tuning teknik som är tillgänglig när du kör RF-PCD kromatografi är förhållandet mellan de centrala och perifera flöden. Det optimala förhållandet för varje derivatisering beror på ett antal faktorer såsom huruvida centralflödet kommer att upptäckas eller gått till spillo. Därför när det optimala förhållandet har bestämts, Bör man se till att rätt flödesförhållandet uppnås före varje körning utförs.

Det har visat sig att användning av en fritta för att blanda Kolonneluenten strömmen och derivatisering reagens i RF-PCD resulterar i mer effektiv blandning jämfört med traditionella blandningsmetoder som typiskt använder en noll dödvolym T-stycke eller låg dödvolym W- bit för att blanda de två strömmarna. Detta har gjort för användning av relativt små reaktions loopar, eller till och med eliminering av reaktionsslingan helt och hållet. Reduktionen av reaktionsslinga storlek resulterar i skarpare toppar jämfört med traditionella postkolonn derivatisering metoder. Detta innebär att trots det faktum att inte alla Kolonneluenten derivatiseras är större signal till brusförhållanden observeras och kan uppnås därmed lägre detektionsgränser och kvantifiering.

Reaktionsflödes kromatografi har utvecklats för att övervinna svårigheter med anpassningen av PCD reaktions till moderna HPLC-kolonner och system, särskilt de effektivitetsförluster som orsakas av bandbreddning på grund av stora postkolonn dödvolymer som orsakas av behovet att använda stora volymer reaktions loopar. De mer effektiva blandningsprocesser i RF-PCD jämfört med konventionella PCD betyda att mindre reaktions loop volymer kan användas vilket leder till en ökning av observerad separationseffektivitet. Dessutom RF-PCD kromatografi visar både ökad signal och minskat buller jämfört med konventionella PCD tekniker resulterar i lägre detektionsgränser och kvantifiering jämfört med konventionella PCD metoder. En ytterligare fördel med RF-PCD jämfört med konventionella PCD-metoder är förmågan att övervaka oderivatiserade strömmen som eluerar från den centrala porten på RF-kolonn såväl som den derivatiserade strömmen som eluerar från det perifera området av kolonnen. RF-PCD är en relativt ny men lovande teknik som visar många fördelar jämfört med traditionella PCD metoder.

<p class="jove_content"> Anslutning av RF-kolonnen uppnås på nästan samma sätt som en konventionell HPLC-kolonn med den stora skillnaden är antalet ändbeslag på en RF-kolonn. Beslag som används för att ansluta en standard-HPLC-kolonn till HPLC-systemet har möjlighet att användas för att ansluta en RF-kolumn till HPLC-systemet.

Protocol

Varning: Se säkerhetsdatablad (SDB) för alla material och reagenser före användning (dvs SDB för metanol). Säkra användningen av alla lämpliga säkerhetsåtgärder vid hantering av lösningsmedel och High Performance Liquid Chromatography (HPLC) elueringsmedel. Säkerställa en lämplig användning av tekniska kontroller av HPLC analytisk balans och detektor instrumentering, och säkra användningen av personlig skyddsutrustning (skyddsglasögon, handskar, skyddsrock, fullängds byxor, och sluten tå skor). Obs: Det…

Representative Results

Den första PCD metod som var anpassad för att användas av RF-PCD var derivatiseringen av antioxidanter med användning av 2,2-difenyl-1-picrylhydrazil radikalen (DPPH •) 24. Denna reaktion introducerades av Koleva et al. 25, och har använts i stor utsträckning sedan. Detekteringen förlitar sig på avfärgning av den DPPH • radikal i närvaro av reaktiva syretyper, därav närvaron av antioxidanter resulterar i en nedgång i den observerade absorbansen. Den D…

Discussion

RF-PCD möjliggör effektiv blandning av derivatiseringen reagens med HPLC utflödet efterkolonn utan användning av reaktionsspolar, minimera effekterna av bandbreddning och förbättra separationsprestanda. RF-PCD metoder har också visat förbättringar i signalsvaret med avseende på detektionsmetoden. Camenzuli et al. ²⁸ var den första att rapportera användning av reaktionsflödeskolonner med DPPH ^• för detektion av ROS i en espressoprov. Deras studie involverade analys och optim…

Materials

HPLC instrument	Agilent	1290 Series HPLC
Additional Pump(s) for derivatisation system	Shimadzu	LC-20A
RF colum			Non-commercial
PEEK tubing	Sigma Aldrich	Z227307
Column stoppers			Provided with column
PEEK tube cutter	Sigma Aldrich	Z290882
Analytical Scale Balance			4-point analytical balance
Stop watch			Non-Scientific equiptment
Eluent collection vials			Any Small vial with a flat bottom will do e.g. HPLC vials
HPLC Vials			Will depend on instrument used
Vessels for mobile phase and derivatisation solution(s)	Sigma Aldrich	Z232211
General Laboratory glassware			Volumetric Flasks, pippettes, etc. Quantity and volumes will depend on sample preparation method
Methanol	Sigma Aldrich	34860
DPPH	Sigma Aldrich	D9132
Ammonium Acetate	Sigma Aldrich	17836
Ammonia	Sigma Aldrich	320145	Corrosive
Acetonitrile	Sigma Aldrich	34998
Fluorescamine	Sigma Aldrich	F9015
4-aminoantipyrene	Acros Organics BVBA	AC103151000
Potassium ferricyanide	AnalaR	B10204-30