Fecal glucocorticoïdes Analyse: Surveillance surrénale non invasive en Equidés
Summary
Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.
Abstract
Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.
Introduction
La méthode décrite vise à analyser les concentrations de corticostérone dans les fèces équins afin de fournir une évaluation non invasive de l'activité surrénale. Mesure de l'activité (HPA) axe hypothalamo-hypophyso-surrénalien est une approche acceptée pour étudier la réponse à des situations potentiellement aversif chez les deux espèces en captivité et domestiques. La technique de référence et la méthode la plus largement utilisée est l'utilisation du plasma sanguin 1 cependant, d' autres méthodes telles que l' analyse fécale ont été développés afin de surmonter le stress induit par le prélèvement de sang lui – même et permettre à la capacité de surveiller les espèces en liberté.
Dans une situation aversif, l'homéostasie physiologique est perturbé. L'hypothalamus dans le cerveau libère Corticolibérine (CRH) qui agit sur l'hypophyse antérieure et stimule la libération de l'hormone corticotrope (ACTH). ACTH pénètre dans le sang et stimule le cortex surrénalien à sécréter espèces glucocorticoïdes spécifiques (GC). Les glucocorticoïdes sont étroitement liés à des événements stressants plutôt que d' être produite de manière cohérente dans tous les états d'énergie accrue par conséquent , ils sont souvent mesurés en priorité sur les autres contraintes liées hormones 2. Les glucocorticoïdes sont responsables de plusieurs effets adaptatifs chez les chevaux. L' énergie est rapidement mobilisée à partir de sites de stockage dans le corps sous la forme d'acides gras et de glucose, l' apport en oxygène est augmentée, la fonction sensorielle est améliorée 3 et le flux sanguin est réduit dans les zones ne sont pas nécessaires pour le mouvement 4. En plus d'agir comme mécanisme d' adaptation, le stress hausse induite par les glucocorticoïdes peut également aider à préparer l'animal pour la prochaine stresseur 5.
L'évaluation des niveaux d'hormones dans le plasma et la salive consiste à mesurer l'hormone circulante réelle cependant, la mesure des métabolites dans les mesures de fèces le produit final métabolique de l'hormone. stéroïdes circulantes sont catabolized dans la lIver avant l' excrétion de la bile où ils subissent d' autres changements facilitées par les activités enzymatiques de la flore bactérienne intestinale dans la piste 6. Par conséquent, immunoessais dirigés vers glucocorticoïdes sanguins peuvent ne pas être adapté à l' analyse des métabolites glucocorticoïdes fécaux 7.
Comme la collecte fécale peut être effectuée sans perturbation du cheval, l'analyse des selles pour la corticostérone, a été largement utilisé pour surveiller l'activité HPA dans un certain nombre de circonstances. Corticostérone Elevated dans les selles des chevaux a été rapporté en réponse à des situations potentiellement aversif , y compris pendant le traitement vétérinaire post-opératoire 8 et dans le logement 9 restrictive. Échantillonnage fécal reflète un niveau de glucocorticoïdes mis en commun au fil du temps plutôt que le point dans l' échantillonnage de temps offert par le plasma et la salive rendant approprié pour le suivi à long terme, chronique ou modèles saisonniers 10. En raison de la non-invasivenature de la méthode, des échantillons peuvent être recueillis à plusieurs reprises pour un individu sans qu'il soit nécessaire de capture ou de retenue 11. Cependant, les espèces spécifiques gut temps de transit doit être pris en compte lors de la planification d'un protocole d'échantillonnage. Chez les chevaux, le temps de transit intestinal est d' environ 18 h 12 donc, la réponse des surrénales et des métabolites de corticostérone ultérieures peuvent être détectées dans les selles un jour après l' activation initiale de l'axe HPA.
Lors de l' utilisation des techniques de dosage immunologique non invasifs une validation minutieuse pour l'espèce étudiée est essentielle 13. En outre, les différences de sexe en hormone métabolite excrétion ont été rapportés probablement en raison de différences dans le taux métabolique et le type de corticostérone métabolite excrété dans diverses espèces , y compris les souris 14, et les poulets 15. Il était donc important dans le cadre de cette méthode que le test a été validé pour une utilisation à la fois mâle et chevaux domestiques comme cela est détaillé dans eProtocole e. Cette différence dans le métabolisme hormonal entre les sexes a des conséquences sur la qualité des données mais il est rarement pris en compte et inclus dans le cadre de la validation du test.
Cette méthode non-invasive permet à long terme l'évaluation de l'activité des glandes surrénales chez les chevaux domestiques. Les détails du protocole à la fois la validation de l'essai et de la technique de dosage elle-même.
Protocol
Representative Results
Discussion
analyse de corticostérone Fecal fournit un moyen d'évaluer les modèles à long terme de l'activité des glandes surrénales chez les chevaux. La nature non-invasive de la méthode permet de surmonter les effets de confusion d'autres méthodes d'échantillonnage utilisées pour évaluer l' activité des glandes surrénales , y compris la salive et le plasma analyse 9. En outre, la technique présente un avantage non-invasive clair si l'étude des chevaux libres allant.
<p class="…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funding for the production of this manuscript was provided by Nottingham Trent University. The authors wish to thank the University yard manager, Anna Gregory for the use of her horses and provision of fecal samples for use in the protocol. Thanks also to Chester Zoo Wildlife Endocrinology Laboratory for use of their facilities.
Materials
| Corticosterone antibody & HRP kit | Coralie Munro – UC Davis | NA | No longer available through UC Davis – please see Arbor Assays |
| Cortisol antibody & HRP kit | Coralie Munro – UC Davis | NA | No longer available through UC Davis – please see Arbor Assays |
| Corticosterone synthetic standard hormone | Sigma Aldrich | 50-23-7 | Harnful if ingested or with skin contact. Use in fume cupboard |
| Cortisol synthetic standard hormone | Sigma Aldrich | 15087-01-1 | Harnful if ingested or with skin contact. Use in fume cupboard |
| Methanol | Sigma Aldrich | 67-56-1 | Irritant. Use in fume cupboard |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | 144-55-8 | Irritant |
| Sodium Carbonate Anhydrous | Sigma Aldrich | 497-19-8 | Irritant |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Aldrich | 7558-79-4 | Irritant |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma Aldrich | 10049-21-5 | Irritant |
| BSA | Sigma Aldrich | 9048-46-8 | Irritant |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | 9005-64-5 | Irritant |
| Citric Acid | Sigma Aldrich | 77-92-9 | Irritant |
| ABTS | Sigma Aldrich | 30931-67-0 | Irritant |
| Hydrogen Peroxide 30% | Sigma Aldrich | 7722-84-1 | Irritant |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | 7647-14-5 | Irritant |
| Buffer capsules – pH 4 | VWR | 332732B | |
| Buffer capsules – pH 7 | VWR | 332742D | |
| Buffer capsules – pH 10 | VWR | 332762H | |
| Hydrochloric Acid | Sigma Aldrich | 435570 | Irritant. Use in fume cupboard |
| Sodium Hydroxide | Sigma Aldrich | S5881 | Irritant |
| Analytical balance | Fisher Scientific | BFS-525-010A | |
| Air compressor | |||
| Centrifuge | |||
| Computer +printer | |||
| fridge-freezer | |||
| Drying apparatus | |||
| +tubing | |||
| Flammable liquid storagecabinet | VWR | 649-002 | |
| Fume cupboard | |||
| Hot-plate stirrer | VWR | 640-282 | |
| Microplate reader | VWR | ||
| Microplate washer | VWR | ||
| pH meter | VWR | ||
| Eppendorf Research® pipettes – multipack option 2 | VWR | ||
| Pipette – 1000ul | VWR | ||
| Pipette – 200ul | VWR | ||
| Pipette – 20ul | VWR | ||
| Repeater pipette | VWR | ||
| Pipette filler | VWR | ||
| Orbital shaker | Progen Scientific | ||
| Sonicator | Hilsonic | ||
| Vortex | VWR | ||
| Warm water bath | |||
| Water purification system | Millipore |
References
- Mormède, P., et al. Exploration of the hypothalamic-pituitary-adrenal function as a tool to evaluate animal welfare. Physiology and Behaviour. 92 (3), 317-339 (2007).
- Lane, J. Can non-invasive glucocorticoid measures be used as reliable indicators of stress in animals?. Animal Welfare. 15 (4), 331-342 (2006).
- Morgan, K. N., Tromborg, C. T. Sources of stress in captivity. Applied Animal Behaviour Science. 102, 262-302 (2007).
- Nelson, R. J. . An introduction to behavioural endocrinology (3rd Ed). , 670-671 (2005).
- Sapolsky, R. M., Romero, L. M., Munck, A. U. How Do Glucocorticoids Influence Stress Responses? Integrating Permissive, Suppressive, Stimulatory, and Preparative Actions. Endocrine Reviews. 21 (1), 55-89 (2000).
- Macdonald, K. M., Macdonald, I. A., Bokkenheuser, V. D., Winter, J., McLernon, A. M., Mosbach, E. H. Degradation of steroids in the human gut. Journal of Lipid Research. 24, 675-700 (1983).
- Young, K. M., et al. Non-invasive monitoring of adrenocortical activity in carnivores by fecal glucocorticoid analysis. General and Comparative Endocrinology. 137, 148-165 (2004).
- Merl, S., Scherzer, S., Palme, R., Mostl, E. Pain causes increased concentrations of glucocorticoid metabolites in horse faeces. Journal of Equine Veterinary Science. 20, 586-590 (2000).
- Yarnell, K., Hall, C., Royle, C., Walker, S. L. Domesticated horses differ in their behavioural and physiological responses to isolated and group housing. Physiology and Behaviour. 143, 51-57 (2015).
- Wielebnowski, N., Watters, J. Applying fecal endocrine monitoring to conservation and behaviour studies of wild mammals: important considerations and preliminary tests. Israel journal of ecology and evolution. 53, 439-460 (2007).
- Palme, R. Measuring fecal steroids: guidelines for a practical application. Annals of the New York Academy of Sciences. 1046, 75-80 (2005).
- Uden, P., Rounsaville, G. R., Wiggans, G. R., Van Soest, P. J. The measurement of liquid and solid digesta retention in ruminants, equines and rabbits given timothy hay. British Journal of Nutrition. 48, 329-339 (1982).
- Goymann, W. Non-invasive monitoring of hormones in bird droppings: biological validations, sampling, extraction, sex differences and the influence of diet on hormone metabolite levels. Annals of the New York Academy of Sciences. 1046, 35-53 (2005).
- Touma, C., sachser, N., Mostl, E., Palme, R. Effects of sex and time of day on metabolism and excretion of corticosterone in urine and feces of mice. General and comparative Endocrinology. 130, 267-278 (2003).
- Rattenbacher, S., Mostl, E., Hackl, R., Ghareeb, K., Palme, R. Measurement of corticosterone metabolites in chicken droppings. British Poultry Science. 45, 704-711 (2004).
- Yarnell, K., Hall, C., Billett, E. An assessment of the aversive nature of an animal management procedure using behavioural and physiological measures. Physiology & Behaviour. 118, 32-39 (2013).
- Goymann, W. On the use of non-invasive hormone research in uncontrolled, natural environments: the problem with sex, diet, metabolic rate and the individual. Methods in Ecology and Evolution. 3, 757-765 (2012).
- Sheriff, M. J., Dantzer, B., Delehanty, B., Palme, R., Boonstra, R. Measuring stress in wildlife: techniques for quantifying glucocorticoids. Oecologia. 166, 614-619 (2011).
- Watson, R., Munro, C. J., Edwards, K. L., Norton, V., Brown, J. L., Walker, S. L. Development of a versatile enzyme immunoassay for non-invasive assessment of glucocorticoid metabolites in a diversity of taxonomic species. General Comparative Endocrinology. 186, 16-24 (2013).
- Touma, C., Palme, R. Measuring fecal glucocorticoid metabolites in mammals and birds: the importance of validation. Annals of the New York Academy of Sciences. 1046, 54-74 (2005).
- Millspaugh, J. J., Washburn, B. E. Use of fecal glucocorticoid metabolite measures in conservation biology research: considerations for application and interpretation. General and Comparative Endocrinology. 138, 189-199 (2004).
