Fecal Análise de glicocorticóides: Non-invasive Monitoring Adrenal em eqüídeos
Summary
Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.
Abstract
Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.
Introduction
O método descrito pretende analisar concentrações de corticosterona em fezes equina, a fim de fornecer uma avaliação não-invasiva da actividade supra-renal. Medir a atividade do hipotálamo-pituitária-adrenal (HPA) é uma abordagem aceite para estudar a resposta a situações potencialmente aversivas em ambas as espécies em cativeiro e domésticos. A técnica de referência e o método mais amplamente utilizado é o uso de um plasma sanguíneo no entanto, métodos alternativos, tais como a análise fecal foram desenvolvidas de modo a ultrapassar a tensão induzida por amostragem de sangue em si e permitem que a capacidade de monitorar as espécies que vão livre.
Durante uma situação de aversivo, homeostase fisiológica é interrompido. O hipotálamo no cérebro libera hormônio liberador de corticotrofina (CRH), que atua na glândula pituitária e estimula a liberação de hormônio adrenocorticotrófico (ACTH). ACTH entra na corrente sanguínea e estimula o córtex adrenal a secretar speciede s glicocorticóides específicos (CG). Os glicocorticóides estão intimamente ligados a eventos estressantes ao invés de ser consistentemente produzidos em todos os estados de energia elevada, portanto, eles são muitas vezes medidos em preferência sobre outros de estresse ligado hormônios 2. Os glucocorticóides são responsáveis por diversos efeitos adaptativos em cavalos. A energia é rapidamente mobilizados a partir de locais de armazenagem no corpo sob a forma de ácidos gordos e de glucose, o consumo de oxigénio é aumentada, a função sensorial é reforçada 3 e o fluxo sanguíneo é reduzido em áreas não necessárias para o movimento 4. Além de atuar como um mecanismo de enfrentamento, o aumento induzido stress na glicocorticóides também pode ajudar a preparar o animal para a próxima estressor 5.
Avaliando os níveis de hormona no plasma e na saliva envolve a medição da hormona em circulação real no entanto, a medição dos metabolitos nas fezes medidas do produto final metabólico da hormona. esteróides circulantes são catabolized na lIver antes da excreção para a bílis onde sofrem mais alterações facilitados pelas atividades enzimáticas da flora bacteriana intestinal dentro da faixa 6. Portanto, imunoensaios dirigidos a glucocorticóides no sangue pode não ser adequado para análise de metabolitos fecais 7 glucocorticóides.
Como recolha de fezes pode ser levada a cabo sem perturbar o cavalo, a análise de fezes para corticosterona, tem sido amplamente utilizado para monitorizar a actividade HPA num número de circunstâncias. Corticosterona elevada nas fezes de cavalos tem sido relatada em resposta a situações potencialmente aversivas, nomeadamente durante o tratamento veterinário pós-operatório 8 e em habitação restritiva 9. Amostragem fecal reflete um nível de glicocorticóides agrupada ao longo do tempo, em vez de o ponto de amostragem de tempo oferecido pelo plasma e saliva tornando-o adequado para o acompanhamento a longo prazo, crónica ou padrões sazonais 10. Devido à não-invasivanatureza do método, as amostras podem ser colhidas repetidamente para um indivíduo sem a necessidade de captura ou de contenção 11. No entanto, as espécies de tempo específico trânsito intestinal deve ser levado em conta no planejamento de um protocolo de amostragem. Em cavalos, tempo de trânsito intestinal é de cerca de 18 h, por conseguinte, 12, resposta adrenal e metabolitos subsequentes de corticosterona pode ser detectado nas fezes um dia após a activação inicial do eixo HPA.
Ao utilizar técnicas de imunoensaio não-invasivos uma validação cuidadosa para a espécie a ser investigada é essencial 13. Além disso, as diferenças de sexo na excreção de metabolitos da hormona foram relatados provavelmente devido a diferenças na taxa metabólica e o tipo de metabólito excretado corticosterona em várias espécies, incluindo ratos, 14 e 15 galinhas. Foi, portanto, importante como parte deste método que o ensaio foi validado para uso em cavalos domésticos masculinos e femininos, como está detalhado no the protocolo. Essa diferença no metabolismo hormonal entre os sexos tem consequências para a qualidade dos dados, no entanto, raramente é abordada e incluído como parte da validação do ensaio.
Este método não-invasivo permite a avaliação de longo prazo da atividade adrenal em cavalos domésticos. Os detalhes do protocolo tanto a validação do ensaio e da técnica de ensaio em si.
Protocol
Representative Results
Discussion
análise de corticosterona fecal fornece um meio de avaliar os padrões de longo prazo da atividade adrenal em cavalos. A natureza não-invasiva do método supera os efeitos de confusão de outros métodos de amostragem utilizados para avaliar a atividade adrenal incluindo saliva e no plasma análise 9. Além disso, a técnica tem uma vantagem não-invasivo claro se estudando cavalos livres que vão.
Há vários pontos-chave para discussão em relação a este método e seu uso ad…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funding for the production of this manuscript was provided by Nottingham Trent University. The authors wish to thank the University yard manager, Anna Gregory for the use of her horses and provision of fecal samples for use in the protocol. Thanks also to Chester Zoo Wildlife Endocrinology Laboratory for use of their facilities.
Materials
| Corticosterone antibody & HRP kit | Coralie Munro – UC Davis | NA | No longer available through UC Davis – please see Arbor Assays |
| Cortisol antibody & HRP kit | Coralie Munro – UC Davis | NA | No longer available through UC Davis – please see Arbor Assays |
| Corticosterone synthetic standard hormone | Sigma Aldrich | 50-23-7 | Harnful if ingested or with skin contact. Use in fume cupboard |
| Cortisol synthetic standard hormone | Sigma Aldrich | 15087-01-1 | Harnful if ingested or with skin contact. Use in fume cupboard |
| Methanol | Sigma Aldrich | 67-56-1 | Irritant. Use in fume cupboard |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | 144-55-8 | Irritant |
| Sodium Carbonate Anhydrous | Sigma Aldrich | 497-19-8 | Irritant |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Aldrich | 7558-79-4 | Irritant |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma Aldrich | 10049-21-5 | Irritant |
| BSA | Sigma Aldrich | 9048-46-8 | Irritant |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | 9005-64-5 | Irritant |
| Citric Acid | Sigma Aldrich | 77-92-9 | Irritant |
| ABTS | Sigma Aldrich | 30931-67-0 | Irritant |
| Hydrogen Peroxide 30% | Sigma Aldrich | 7722-84-1 | Irritant |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | 7647-14-5 | Irritant |
| Buffer capsules – pH 4 | VWR | 332732B | |
| Buffer capsules – pH 7 | VWR | 332742D | |
| Buffer capsules – pH 10 | VWR | 332762H | |
| Hydrochloric Acid | Sigma Aldrich | 435570 | Irritant. Use in fume cupboard |
| Sodium Hydroxide | Sigma Aldrich | S5881 | Irritant |
| Analytical balance | Fisher Scientific | BFS-525-010A | |
| Air compressor | |||
| Centrifuge | |||
| Computer +printer | |||
| fridge-freezer | |||
| Drying apparatus | |||
| +tubing | |||
| Flammable liquid storagecabinet | VWR | 649-002 | |
| Fume cupboard | |||
| Hot-plate stirrer | VWR | 640-282 | |
| Microplate reader | VWR | ||
| Microplate washer | VWR | ||
| pH meter | VWR | ||
| Eppendorf Research® pipettes – multipack option 2 | VWR | ||
| Pipette – 1000ul | VWR | ||
| Pipette – 200ul | VWR | ||
| Pipette – 20ul | VWR | ||
| Repeater pipette | VWR | ||
| Pipette filler | VWR | ||
| Orbital shaker | Progen Scientific | ||
| Sonicator | Hilsonic | ||
| Vortex | VWR | ||
| Warm water bath | |||
| Water purification system | Millipore |
References
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