Fecal Glukokortikoid analyse: Ikke-invasiv Adrenal Monitoring i Equids
Summary
Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.
Abstract
Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.
Introduction
Fremgangsmåten som er beskrevet har som mål å analysere kortikosteron konsentrasjoner i equine avføring for å tilveiebringe en ikke-invasiv evaluering av adrenal aktivitet. Måling hypothalamus-hypofyse-binyre (HPA) aksen aktivitet er en akseptert metode for å studere responsen på potensielt aversive situasjoner både i fangenskap og innenlandske arter. Referanse teknikk, og den mest brukte metode er bruk av en blodplasma har imidlertid alternative metoder som fekal analyse blitt utviklet for å overvinne den spenning som induseres av blodprøver i seg selv og tillater muligheten til å overvåke frie strekker arter.
I løpet av en motvilje situasjon, er fysiologisk homeostase forstyrret. Hypothalamus i hjernen utgivelser Corticotrophin hormon (CRH) som virker på fremre hypofysen og stimulerer frigjøring av adrenokortikotropt hormon (ACTH). ACTH kommer inn i blodet og stimulerer binyrebarken til å skille ut speciefinnes spesifikke glukokortikoider (GC). Glukokortikoider er nært knyttet til stressende hendelser snarere enn å være konsekvent produsert i alle energi økt statene derfor er de ofte målt i preferanse over andre stress knyttet hormoner 2. Glukokortikoider er ansvarlig for flere adaptive effekter i hester. Energi blir raskt mobiliseres fra lagringssteder i kroppen i form av fettsyrer og glukose, er oksygenopptak økes, sensorisk funksjon forsterkes 3 og blodstrømmen reduseres til områder som ikke er nødvendige for bevegelse fire. I tillegg til å fungere som en mestring mekanisme, kan stress-indusert økning i Glukokortikoider også hjelpe til å forberede dyret for den neste stressor 5.
Vurdering av hormonnivået i plasma og spytt omfatter måling av den faktiske sirkulerende hormon imidlertid måling av metabolitter i faeces måler den metabolske sluttproduktet av hormonet. Sirkulasjons steroider er catabolized i lIver før utskillelse i å gallen der de gjennomgår ytterligere endringer tilrettelagt av enzymatiske aktiviteter bakteriefloraen i tarm spor 6. Derfor kan immunoanalyser rettet mot blod glukokortikoider, ikke være egnet for analyse av fecal glukokortikoid metabolitter 7.
Som fecal samling kan utføres uten forstyrrelse til hesten, analyse av avføring for kortikosteron, har blitt brukt i stor utstrekning for å overvåke HPA-aktivitet i en rekke forhold. Forhøyet corticosterone i avføringen til hestene har blitt rapportert i respons til potensielt aversive situasjoner, inkludert ved postoperativ veterinærbehandling 8 og i restriktiv bolig 9. Fekal sampling reflekterer en samle glukokortikoid nivå over tid i stedet for det tidspunkt samplings som tilbys ved hjelp av plasma og spytt slik at det er passende for overvåkning av langvarig, kronisk eller sesongmønster 10. På grunn av den ikke-invasivnatur av fremgangsmåten, kan prøvene bli samlet gjentatte ganger for en person uten behov for å fange eller tilbakeholdenhet 11. Imidlertid må artsspesifikk gut transitt-tiden tas i betraktning ved planlegging av en prøvetakings protokoll. Hos hester, er gut transittiden rundt 18 timer 12 og derfor kan adrenal respons og etterfølgende kortikosteron metabolitter påvises i avføringen en dag etter første aktivering av HPA-akse.
Når utnytte ikke-invasive immunologiske teknikker en forsiktig validering for arten som undersøkes er avgjørende 13. I tillegg har kjønnsforskjeller i hormone metabolitt utskillelse blitt rapportert sannsynligvis på grunn av forskjeller i metabolic rate og type corticosterone metabolitt utskilles i ulike arter, inkludert mus 14 og kyllinger 15. Det var derfor viktig som en del av denne metoden at analysen ble validert for bruk i både mannlige og kvinnelige norske hester som er detaljert i the-protokollen. Denne forskjellen i hormon metabolisme mellom kjønnene har konsekvenser for datakvalitet, men det er sjelden adressert og inngår som en del av analysen validering.
Denne ikke-invasiv metode tillater langsiktig vurdering av adrenal aktivitet i innenlandske hester. Protokollinformasjon både validering av analysen og undersøkelsesteknikken selv.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fecal corticosterone analysen gir et middel for å vurdere langsiktige mønstre av adrenal aktivitet i hester. Den ikke-invasiv metode overvinner konfunderende effekter av andre prøvetakingsmetoder som brukes for å vurdere adrenal aktivitet, inkludert spytt og plasma analyse ni. I tillegg teknikken har en klar ikke-invasiv fordel om å studere gratis spenner hester.
Det er flere viktige punkter å diskutere om denne metoden og dens passende bruk. Et kritisk punkt i protokollen e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funding for the production of this manuscript was provided by Nottingham Trent University. The authors wish to thank the University yard manager, Anna Gregory for the use of her horses and provision of fecal samples for use in the protocol. Thanks also to Chester Zoo Wildlife Endocrinology Laboratory for use of their facilities.
Materials
| Corticosterone antibody & HRP kit | Coralie Munro – UC Davis | NA | No longer available through UC Davis – please see Arbor Assays |
| Cortisol antibody & HRP kit | Coralie Munro – UC Davis | NA | No longer available through UC Davis – please see Arbor Assays |
| Corticosterone synthetic standard hormone | Sigma Aldrich | 50-23-7 | Harnful if ingested or with skin contact. Use in fume cupboard |
| Cortisol synthetic standard hormone | Sigma Aldrich | 15087-01-1 | Harnful if ingested or with skin contact. Use in fume cupboard |
| Methanol | Sigma Aldrich | 67-56-1 | Irritant. Use in fume cupboard |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | 144-55-8 | Irritant |
| Sodium Carbonate Anhydrous | Sigma Aldrich | 497-19-8 | Irritant |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Aldrich | 7558-79-4 | Irritant |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma Aldrich | 10049-21-5 | Irritant |
| BSA | Sigma Aldrich | 9048-46-8 | Irritant |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | 9005-64-5 | Irritant |
| Citric Acid | Sigma Aldrich | 77-92-9 | Irritant |
| ABTS | Sigma Aldrich | 30931-67-0 | Irritant |
| Hydrogen Peroxide 30% | Sigma Aldrich | 7722-84-1 | Irritant |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | 7647-14-5 | Irritant |
| Buffer capsules – pH 4 | VWR | 332732B | |
| Buffer capsules – pH 7 | VWR | 332742D | |
| Buffer capsules – pH 10 | VWR | 332762H | |
| Hydrochloric Acid | Sigma Aldrich | 435570 | Irritant. Use in fume cupboard |
| Sodium Hydroxide | Sigma Aldrich | S5881 | Irritant |
| Analytical balance | Fisher Scientific | BFS-525-010A | |
| Air compressor | |||
| Centrifuge | |||
| Computer +printer | |||
| fridge-freezer | |||
| Drying apparatus | |||
| +tubing | |||
| Flammable liquid storagecabinet | VWR | 649-002 | |
| Fume cupboard | |||
| Hot-plate stirrer | VWR | 640-282 | |
| Microplate reader | VWR | ||
| Microplate washer | VWR | ||
| pH meter | VWR | ||
| Eppendorf Research® pipettes – multipack option 2 | VWR | ||
| Pipette – 1000ul | VWR | ||
| Pipette – 200ul | VWR | ||
| Pipette – 20ul | VWR | ||
| Repeater pipette | VWR | ||
| Pipette filler | VWR | ||
| Orbital shaker | Progen Scientific | ||
| Sonicator | Hilsonic | ||
| Vortex | VWR | ||
| Warm water bath | |||
| Water purification system | Millipore |
References
- Mormède, P., et al. Exploration of the hypothalamic-pituitary-adrenal function as a tool to evaluate animal welfare. Physiology and Behaviour. 92 (3), 317-339 (2007).
- Lane, J. Can non-invasive glucocorticoid measures be used as reliable indicators of stress in animals?. Animal Welfare. 15 (4), 331-342 (2006).
- Morgan, K. N., Tromborg, C. T. Sources of stress in captivity. Applied Animal Behaviour Science. 102, 262-302 (2007).
- Nelson, R. J. . An introduction to behavioural endocrinology (3rd Ed). , 670-671 (2005).
- Sapolsky, R. M., Romero, L. M., Munck, A. U. How Do Glucocorticoids Influence Stress Responses? Integrating Permissive, Suppressive, Stimulatory, and Preparative Actions. Endocrine Reviews. 21 (1), 55-89 (2000).
- Macdonald, K. M., Macdonald, I. A., Bokkenheuser, V. D., Winter, J., McLernon, A. M., Mosbach, E. H. Degradation of steroids in the human gut. Journal of Lipid Research. 24, 675-700 (1983).
- Young, K. M., et al. Non-invasive monitoring of adrenocortical activity in carnivores by fecal glucocorticoid analysis. General and Comparative Endocrinology. 137, 148-165 (2004).
- Merl, S., Scherzer, S., Palme, R., Mostl, E. Pain causes increased concentrations of glucocorticoid metabolites in horse faeces. Journal of Equine Veterinary Science. 20, 586-590 (2000).
- Yarnell, K., Hall, C., Royle, C., Walker, S. L. Domesticated horses differ in their behavioural and physiological responses to isolated and group housing. Physiology and Behaviour. 143, 51-57 (2015).
- Wielebnowski, N., Watters, J. Applying fecal endocrine monitoring to conservation and behaviour studies of wild mammals: important considerations and preliminary tests. Israel journal of ecology and evolution. 53, 439-460 (2007).
- Palme, R. Measuring fecal steroids: guidelines for a practical application. Annals of the New York Academy of Sciences. 1046, 75-80 (2005).
- Uden, P., Rounsaville, G. R., Wiggans, G. R., Van Soest, P. J. The measurement of liquid and solid digesta retention in ruminants, equines and rabbits given timothy hay. British Journal of Nutrition. 48, 329-339 (1982).
- Goymann, W. Non-invasive monitoring of hormones in bird droppings: biological validations, sampling, extraction, sex differences and the influence of diet on hormone metabolite levels. Annals of the New York Academy of Sciences. 1046, 35-53 (2005).
- Touma, C., sachser, N., Mostl, E., Palme, R. Effects of sex and time of day on metabolism and excretion of corticosterone in urine and feces of mice. General and comparative Endocrinology. 130, 267-278 (2003).
- Rattenbacher, S., Mostl, E., Hackl, R., Ghareeb, K., Palme, R. Measurement of corticosterone metabolites in chicken droppings. British Poultry Science. 45, 704-711 (2004).
- Yarnell, K., Hall, C., Billett, E. An assessment of the aversive nature of an animal management procedure using behavioural and physiological measures. Physiology & Behaviour. 118, 32-39 (2013).
- Goymann, W. On the use of non-invasive hormone research in uncontrolled, natural environments: the problem with sex, diet, metabolic rate and the individual. Methods in Ecology and Evolution. 3, 757-765 (2012).
- Sheriff, M. J., Dantzer, B., Delehanty, B., Palme, R., Boonstra, R. Measuring stress in wildlife: techniques for quantifying glucocorticoids. Oecologia. 166, 614-619 (2011).
- Watson, R., Munro, C. J., Edwards, K. L., Norton, V., Brown, J. L., Walker, S. L. Development of a versatile enzyme immunoassay for non-invasive assessment of glucocorticoid metabolites in a diversity of taxonomic species. General Comparative Endocrinology. 186, 16-24 (2013).
- Touma, C., Palme, R. Measuring fecal glucocorticoid metabolites in mammals and birds: the importance of validation. Annals of the New York Academy of Sciences. 1046, 54-74 (2005).
- Millspaugh, J. J., Washburn, B. E. Use of fecal glucocorticoid metabolite measures in conservation biology research: considerations for application and interpretation. General and Comparative Endocrinology. 138, 189-199 (2004).
