Fekal Glukokortikoid Analys: Icke-invasiv Adrenal Övervakning av equids
Summary
Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.
Abstract
Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.
Introduction
Den beskrivna metoden syftar till att analysera kortikosteron koncentrationer i häst avföring för att ge en icke-invasiv utvärdering av adrenal aktivitet. Mätning hypotalamus-hypofys-binjure (HPA) axel aktivitet är en accepterad metod för att studera svaret på potentiellt aversiva situationer i både fångenskap och tamdjur. Referens teknik och den mest använda metoden är användningen av blodplasma en har dock alternativa metoder såsom fekal analys har utvecklats för att övervinna stress som blodprovstagning själv och låta möjlighet att övervaka fria spänner arter.
Under ett bitter situation, är fysiologisk homeostas störs. Hypotalamus i hjärnan släpper kortikotropinfrisättande hormon (CRH), som verkar på den främre hypofysen och stimulerar frisättning av adrenokortikotropt hormon (ACTH). ACTH kommer in i blodomloppet och stimulerar binjurebarken att utsöndra specieS specifika glukokortikoider (GC). Glukokortikoider är nära kopplade till stressande händelser i stället för att konsekvent på samtliga energi ökade stater därför de ofta mäts i företräde framför andra stress kopplade hormoner 2. Glukokortikoider är ansvariga för flera adaptiva effekter hos hästar. Energi snabbt mobiliseras från lagringsplatser i kroppen i form av fettsyror och glukos, är syreupptagning ökas, sensorisk funktion förstärks 3 och blodflöde sänks till områden som inte är nödvändiga för rörelse 4. Samt fungerar som en coping mekanism, kan stressen inducerad ökning av Glukokortikoider också bidra till att förbereda djur för nästa stress 5.
Uppskatta hormonnivåer i plasma och saliv innebär att mäta den verkliga cirkulerande hormon dock mäta metaboliter i faeces mäter metaboliska slutprodukten av hormonet. Cirkulerande steroider kataboliseras i liver före utsöndring in i galla där de genomgår ytterligare ändringar underlättas av de enzymatiska aktiviteter bakteriefloran i tarmen spår 6. Därför kan immun riktade mot blod glukokortikoider inte vara lämplig för analys av fekal glukokortikoid metaboliter 7.
Som fekal samling kan genomföras utan störningar till hästen, analys av avföring för kortikosteron, har använts i stor utsträckning för att övervaka HPA-aktivitet i ett antal omständigheter. Förhöjda kortikosteron i avföringen av hästar har rapporterats till följd av potentiellt aversiva situationer även under postoperativ veterinärvård 8 och begränsande höljet 9. Fekal provtagning reflekterar en sammanslagen glukokortikoid nivå över tiden snarare än den tidpunkt provtagning erbjuds av plasma och saliv vilket gör det lämpligt för att övervaka långsiktigt kronisk eller säsongsmönster 10. På grund av den icke-invasivanaturen av metoden, kan prover samlas in upprepade gånger för en individ utan behov för infångning eller fasthållnings 11. Dock måste artspecifik tarmpassagetiden beaktas när man planerar ett provtagningsprotokoll. Hos hästar, är tarmpassagetiden cirka 18 timmar 12 därför kan adrenal respons och efterföljande kortikosteron metaboliter påvisas i avföringen en dag efter initial aktivering av HPA-axeln.
Vid användning av icke-invasiva immunanalysmetoder en noggrann validering för arten utreds är viktigt 13. Dessutom har könsskillnader i hormon metabolit utsöndring rapporterats förmodligen på grund av skillnader i ämnesomsättning och typ av kortikosteron metabolit utsöndras i olika arter, inklusive möss 14, och kycklingar 15. Det var därför viktigt som en del av denna metod att analysen validerades för användning i både manliga och kvinnliga inhemska hästar som är detaljerad i the-protokollet. Denna skillnad i hormonmetabolism mellan könen har konsekvenser för datakvalitet men det är sällan behandlas och ingår som en del av analys validering.
Denna icke-invasiv metod möjliggör långsiktig bedömning av adrenal aktivitet i inhemska hästar. Protokollet detaljer både validering av analysen och analysteknik själva.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fekal kortikosteron analys ger en möjlighet att bedöma långsiktiga mönster av adrenal aktivitet hos hästar. Den icke-invasiva karaktär metoden övervinner de störande effekterna av andra provtagningsmetoder som används för att bedöma adrenal aktivitet inklusive saliv och plasma analys 9. Dessutom tekniken har en tydlig icke-invasiv fördel om studera gratis sträcker hästar.
Det finns flera viktiga punkter att diskutera om denna metod och dess lämplig användning. Ett …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funding for the production of this manuscript was provided by Nottingham Trent University. The authors wish to thank the University yard manager, Anna Gregory for the use of her horses and provision of fecal samples for use in the protocol. Thanks also to Chester Zoo Wildlife Endocrinology Laboratory for use of their facilities.
Materials
| Corticosterone antibody & HRP kit | Coralie Munro – UC Davis | NA | No longer available through UC Davis – please see Arbor Assays |
| Cortisol antibody & HRP kit | Coralie Munro – UC Davis | NA | No longer available through UC Davis – please see Arbor Assays |
| Corticosterone synthetic standard hormone | Sigma Aldrich | 50-23-7 | Harnful if ingested or with skin contact. Use in fume cupboard |
| Cortisol synthetic standard hormone | Sigma Aldrich | 15087-01-1 | Harnful if ingested or with skin contact. Use in fume cupboard |
| Methanol | Sigma Aldrich | 67-56-1 | Irritant. Use in fume cupboard |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | 144-55-8 | Irritant |
| Sodium Carbonate Anhydrous | Sigma Aldrich | 497-19-8 | Irritant |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Aldrich | 7558-79-4 | Irritant |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma Aldrich | 10049-21-5 | Irritant |
| BSA | Sigma Aldrich | 9048-46-8 | Irritant |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | 9005-64-5 | Irritant |
| Citric Acid | Sigma Aldrich | 77-92-9 | Irritant |
| ABTS | Sigma Aldrich | 30931-67-0 | Irritant |
| Hydrogen Peroxide 30% | Sigma Aldrich | 7722-84-1 | Irritant |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | 7647-14-5 | Irritant |
| Buffer capsules – pH 4 | VWR | 332732B | |
| Buffer capsules – pH 7 | VWR | 332742D | |
| Buffer capsules – pH 10 | VWR | 332762H | |
| Hydrochloric Acid | Sigma Aldrich | 435570 | Irritant. Use in fume cupboard |
| Sodium Hydroxide | Sigma Aldrich | S5881 | Irritant |
| Analytical balance | Fisher Scientific | BFS-525-010A | |
| Air compressor | |||
| Centrifuge | |||
| Computer +printer | |||
| fridge-freezer | |||
| Drying apparatus | |||
| +tubing | |||
| Flammable liquid storagecabinet | VWR | 649-002 | |
| Fume cupboard | |||
| Hot-plate stirrer | VWR | 640-282 | |
| Microplate reader | VWR | ||
| Microplate washer | VWR | ||
| pH meter | VWR | ||
| Eppendorf Research® pipettes – multipack option 2 | VWR | ||
| Pipette – 1000ul | VWR | ||
| Pipette – 200ul | VWR | ||
| Pipette – 20ul | VWR | ||
| Repeater pipette | VWR | ||
| Pipette filler | VWR | ||
| Orbital shaker | Progen Scientific | ||
| Sonicator | Hilsonic | ||
| Vortex | VWR | ||
| Warm water bath | |||
| Water purification system | Millipore |
References
- Mormède, P., et al. Exploration of the hypothalamic-pituitary-adrenal function as a tool to evaluate animal welfare. Physiology and Behaviour. 92 (3), 317-339 (2007).
- Lane, J. Can non-invasive glucocorticoid measures be used as reliable indicators of stress in animals?. Animal Welfare. 15 (4), 331-342 (2006).
- Morgan, K. N., Tromborg, C. T. Sources of stress in captivity. Applied Animal Behaviour Science. 102, 262-302 (2007).
- Nelson, R. J. . An introduction to behavioural endocrinology (3rd Ed). , 670-671 (2005).
- Sapolsky, R. M., Romero, L. M., Munck, A. U. How Do Glucocorticoids Influence Stress Responses? Integrating Permissive, Suppressive, Stimulatory, and Preparative Actions. Endocrine Reviews. 21 (1), 55-89 (2000).
- Macdonald, K. M., Macdonald, I. A., Bokkenheuser, V. D., Winter, J., McLernon, A. M., Mosbach, E. H. Degradation of steroids in the human gut. Journal of Lipid Research. 24, 675-700 (1983).
- Young, K. M., et al. Non-invasive monitoring of adrenocortical activity in carnivores by fecal glucocorticoid analysis. General and Comparative Endocrinology. 137, 148-165 (2004).
- Merl, S., Scherzer, S., Palme, R., Mostl, E. Pain causes increased concentrations of glucocorticoid metabolites in horse faeces. Journal of Equine Veterinary Science. 20, 586-590 (2000).
- Yarnell, K., Hall, C., Royle, C., Walker, S. L. Domesticated horses differ in their behavioural and physiological responses to isolated and group housing. Physiology and Behaviour. 143, 51-57 (2015).
- Wielebnowski, N., Watters, J. Applying fecal endocrine monitoring to conservation and behaviour studies of wild mammals: important considerations and preliminary tests. Israel journal of ecology and evolution. 53, 439-460 (2007).
- Palme, R. Measuring fecal steroids: guidelines for a practical application. Annals of the New York Academy of Sciences. 1046, 75-80 (2005).
- Uden, P., Rounsaville, G. R., Wiggans, G. R., Van Soest, P. J. The measurement of liquid and solid digesta retention in ruminants, equines and rabbits given timothy hay. British Journal of Nutrition. 48, 329-339 (1982).
- Goymann, W. Non-invasive monitoring of hormones in bird droppings: biological validations, sampling, extraction, sex differences and the influence of diet on hormone metabolite levels. Annals of the New York Academy of Sciences. 1046, 35-53 (2005).
- Touma, C., sachser, N., Mostl, E., Palme, R. Effects of sex and time of day on metabolism and excretion of corticosterone in urine and feces of mice. General and comparative Endocrinology. 130, 267-278 (2003).
- Rattenbacher, S., Mostl, E., Hackl, R., Ghareeb, K., Palme, R. Measurement of corticosterone metabolites in chicken droppings. British Poultry Science. 45, 704-711 (2004).
- Yarnell, K., Hall, C., Billett, E. An assessment of the aversive nature of an animal management procedure using behavioural and physiological measures. Physiology & Behaviour. 118, 32-39 (2013).
- Goymann, W. On the use of non-invasive hormone research in uncontrolled, natural environments: the problem with sex, diet, metabolic rate and the individual. Methods in Ecology and Evolution. 3, 757-765 (2012).
- Sheriff, M. J., Dantzer, B., Delehanty, B., Palme, R., Boonstra, R. Measuring stress in wildlife: techniques for quantifying glucocorticoids. Oecologia. 166, 614-619 (2011).
- Watson, R., Munro, C. J., Edwards, K. L., Norton, V., Brown, J. L., Walker, S. L. Development of a versatile enzyme immunoassay for non-invasive assessment of glucocorticoid metabolites in a diversity of taxonomic species. General Comparative Endocrinology. 186, 16-24 (2013).
- Touma, C., Palme, R. Measuring fecal glucocorticoid metabolites in mammals and birds: the importance of validation. Annals of the New York Academy of Sciences. 1046, 54-74 (2005).
- Millspaugh, J. J., Washburn, B. E. Use of fecal glucocorticoid metabolite measures in conservation biology research: considerations for application and interpretation. General and Comparative Endocrinology. 138, 189-199 (2004).
