En strategi at validere rolle Callose-medieret Plasmodesmal gating i Tropic svar

Summary

Denne artikel beskriver metoderne til screening af gener, der kontrollerer plasmodesmal permeabilitet og dermed auxin gradient under tropiske respons. Dette omfatter måling af graden af ​​tropiske respons i hypokotyle af Arabidopsis thaliana og kontrol plasmodesmal permeabilitet med 8-hydroxypyren-1,3,6-trisulfonsyre (HPTS) lastning og vurdering endelig callose niveau.

Abstract

Anlægget hormon auxin spiller en vigtig rolle i mange vækst- og udviklingsprocesser, herunder tropiske reaktioner på lys og tyngdekraft. Etableringen af ​​en auxin gradient er en central begivenhed, der medfører fototropisme og gravitropism. Tidligere blev polar auxin transport (PAT) vist at etablere en auxin gradient i forskellige cellulære domæner af planter. Men Han et al. Nylig vist, at for korrekt auxin gradient dannelse, plasmodesmal callose-medieret symplasmic konnektivitet mellem de tilstødende celler er også en kritisk faktor. I dette manuskript, til den strategi, belyse den rolle, bestemte gener, som kan påvirke fototropisme og gravitropism ved at ændre symplasmic tilslutning via modulerende plasmodesmal callose syntese, diskuteres. Det første skridt er at screene afvigende tropiske svar fra 3 dage gamle etiolerede frøplanter af mutanter eller over-udtryk linjer af et gen sammen med den vilde type. Denne indledende screeningkan føre til identifikation af en række gener fungerer i PAT eller kontrollerende symplasmic tilslutningsmuligheder. Den anden screening indebærer sortering af kandidater, der viser ændrede tropiske svar ved at påvirke symplasmic tilslutningsmuligheder. For at imødegå sådanne kandidater, blev bevægelsen af ​​en symplasmic sporstof og aflejring af plasmodesmal callose undersøgt. Denne strategi vil være nyttigt at udforske nye kandidatgener, der kan regulere symplasmic konnektivitet direkte eller indirekte under tropic svar og andre udviklingsprocesser.

Introduction

Planter, som sessile levende organismer, har udviklet en meget avanceret netværk af celle-til-cellesignalering at løse forskellige miljømæssige stimuli. Tropic responser er en af ​​de fænomener, som planter reagerer på miljømæssige stimuli. Planter viser to vigtigste tropiske svar, fototropisme og gravitropism. Fotosyntetiske planter bøje mod lyskilden ved fototropisme at høste maksimal energi. Tilsvarende gravitropism gør planterne at vokse mod tyngdepunkt. Den grundlæggende mekanisme, der fører til sådanne tropiske reaktioner involverer asymmetrisk gradient dannelse af phytohormonet auxin ^en. Det handler om lokale auxin gradient dannelse er godt karakteriseret; de gener, der er involveret i denne mekanisme giver en køreplan for hormon handling ^2-8. Den specifikke placering af auxin efflux bærere, såsom PIN-formed (PIN) og p-glycoproteiner, udfører bevægelsen af auxin fra cytoplasmaet til cellevæggen af donorceller ^9,10. Furthermore, ved den aktive H ⁺ / IAA symport aktivitet af auxin tilstrømning bærere, såsom AUX1 / LAX familie proteiner, auxin er endelig leveret til de tilstødende modtager celler ^2,11,12. Denne retningsbestemt bevægelse af auxin er kendt som polar auxin transport (PAT). PAT fører til en differentiel auxin fordeling under forskellige udviklingsstadier og som reaktion på forskellige miljømæssige stimuli ^13,14. Desuden afbrydelse i lokalisering eller ekspression af nogen af ​​disse auxin indstrømning eller efflux bærere fører til alvorlig ændring i PAT, som forårsager en afbrydelse af den auxin-gradient, hvilket fører til udviklingsmæssige defekter. For nylig, Han et al. rapporterede, at plasmodesmal forordning er også nødvendig for at opretholde auxin gradient ^15. Til dato har mere end 30 plasmodesmal proteiner blevet identificeret ^16. Blandt disse proteiner har AtGSL8 blevet rapporteret som et centralt enzym til callose syntese ved plasmodesmata (PD), og derfor spiller en afgørende rolle i maintaining grænse PD udelukkelse størrelse (SEL). Undertrykt AtGSL8 udtryk resulterede i en forvrænget auxin gradient mønster fører til ingen tropiske respons i modsætning til vildtype kimplanter ^15.

I dette manuskript, metoder udforske nye kandidatgener, der er involveret i PD regulering leveres. AtGSL8 blev anvendt som en model protein for at teste disse metoder, da det er et vigtigt enzym bidrager til PD callose biosyntese. På grund af den kimplante-letalitet gsl8 knock-out mutanter ^17, blev dexamethason (dex) inducerbare RNAi linjer anvendes i overensstemmelse med en tidligere offentliggjort rapport ^15. Oplysningerne her strategi kan tilpasses til at screene gener, der er impliceret i hypokotyle tropic respons kontrolleret af PD SEL.

Protocol

1. Screening af mutanter med ændret fototropisk og Gravitropic Responses Forbered 1x Murashige og Skoog (MS) Medium, pH 5,7, med 0,8% Agar en dag før forsøget. Tilsættes 800 ml dobbelt destilleret vand til en 2 L konisk kolbe og omrøres med en magnetisk stang. Tilføj 4,4 g MS salt til den koniske kolbe. Tilsæt 0,5 g 2- (N-morpholino) ethansulfonsyre (MES) og omrør indtil alle saltene er fuldstændig opløst. Justere mediets pH til 5,7 med 1 M KOH. Overf…

Representative Results

I den nuværende setup, dexamethason (dex) inducerbare RNAi linjer af AtGSL8 [herefter dsGSL8 (+ k s / -dex)] blev anvendt, som homozygot gsl8 T-DNA indsættelse mutanter er sætteplante dødbringende 18. Tre dage gamle etiolerede frøplanter af dsGSL8 og vild type frøplanter med ± dex blev udsat for fototropisk og gravitropic stimuli. Vi fandt, at dsGSL8 (+ dex) kimplanter var defekte i fototropisme og gravitropism 15….

Discussion

I dette manuskript, til en strategi screene mutant / over-udtryk linjer, der er defekte fototropisk og gravitropic reaktioner som følge af ændret PD callose og dermed er PD SEL beskrevet i detaljer. PD callose syntese og nedbrydning hovedsageligt opnås ved callose syntaser og β-1,3-glucanaser, men reguleringen af ​​disse enzymer er kontrolleret af mange opstrøms faktorer. For at søge efter sådanne opstrøms faktorer eller kandidater, der er direkte involveret i PD regulering, har vi oprettet denne metode til …

Materials

HPTS (8-Hydroxypyrene -1,3,6-trisulfonic acid trisodium salt)	Sigma	H1529-1G	Fluorescent dye as symplasmic tracer
LE Agarose	Dongin-Genomic	GEL001-500G	Used for HPTS agarose block
Microwave oven	LG-Goldstar		Machine for boiling agarose gel
100 mL glass conical flask	Dong Kwang	A0205	Used to boil HPTS agarose gel
Petri Dish (35×10 mm)	SPL life sciences	SPL10035	Used to make HPTS agarose blocks and wash plant samples
Microscope cover slides and glass slides (24 x 50 mm)	Marienfeld Laboratory Glassware	101222	Used for HPTS agarose blocks and microscopic sample preparation
MS medium plates 125 x 125 x 20 mm	SPL life sciences	SPL11125	Plates to make MS agar medium
Scissors	Germany Stainless	HSB 942-11	Used to excise hook region of plant samples
Murashige and Skoog (MS) basal salt mixture	Duchefa	P10453.01	MS medium including vitamins.
(N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES) monohydrate	Bioshop	3G30212	To make MS media.
Plant agar	Duchefa	P1001.1000	To solidify MS media.
Autoclave	ALP	CL-40L
Shaker	Wise Mix	SHO-1D	To wash off the aniline blue staining buffer and HPTS dye in a placid way.
1 ml Blue tips	Sorenson	10040
1 ml pipette	BioPette	L-1101-2
Surgical tape	MIcropore	1530-0	To seal the MS plate
Aniline blue (Methyl blue)	Sigma	M5528-25G	Used to prepare aniline blue staining buffer.
Glycine	Bioshop	GLN001	Used to prepare aniline blue staining buffer.
DDG	Sigma	D8375-1G	Used for the inhibition of callose synthases.
Confocal microscope	Olympus	FV1000MPE SIM	To check aniline blue staining and HPTS dye loading result.
Stirrer	I lab	K400	To mix media solution.
Aluminium foil	SW cooking foil		To wrap plates in a dark condition.
Sodium hypochlorite	Samjin Industry		To surface-sterilized seeds