Стратегия для обоснования роли каллозы опосредованной Plasmodesmal воротного в Tropic Response
Summary
В данной статье описаны способы скрининга генов, контролирующих plasmodesmal проницаемость и, следовательно, градиент ауксина во время реакции тропика. Это включает в себя измерение степени троповых ответа в гипокотиля из Резуховидка Таля и проверки plasmodesmal проницаемости по 8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonic кислоты (HPTs) загрузки и оценки , наконец , каллозы уровня.
Abstract
Ауксина растений гормон играет важную роль во многих роста и развития процессов, в том числе трофических реакции на свет и силу тяжести. Создание градиента ауксина является ключевым событием приводит к фототропизма и геотропизм. Ранее было показано, полярный транспорт ауксина (PAT), чтобы создать градиент ауксина в различных клеточных доменах растений. Тем не менее, Хан и др. Недавно продемонстрировали , что для правильного формирования ауксина градиента, plasmodesmal мозолистый-опосредованной symplasmic связность между соседними ячейками также является критическим фактором. В этой рукописи, стратегия для выяснения роли конкретных генов, которые могут повлиять на фототропизм и геотропизм путем изменения symplasmic соединений посредством модулирования plasmodesmal синтеза каллозы, обсуждается. Первым шагом является скрининг аберрантных ответов Тропик от 3-дневных этиолированных проростков мутантов или сверхэкспрессии линий гена наряду с диким типом. Этот предварительный скринингможет привести к идентификации целого ряда генов, функционирующих в PAT или контролирующих symplasmic подключения. Второй скрининг включает в себя сортировку кандидатов, которые показывают измененные Тропик реакции, воздействуя symplasmic подключения. Для решения таких кандидатов, движение в symplasmic трассирующими и осаждение plasmodesmal каллозы были исследованы. Эта стратегия будет полезна для изучения новых генов-кандидатов, которые могут регулировать symplasmic соединения прямо или косвенно в процессе трофических реакций и других процессов развития.
Introduction
Растения, как и сидячих живых организмов, разработали очень сложную сеть от клетки к клетке сигнализации для решения различных экологических стимулов. Tropic ответы являются одним из явлений, с помощью которых растения реагируют на стимулы окружающей среды. Растения показывают два основных тропическое отклики, фототропизм и геотропизм. Фотосинтетические растения согнуться в сторону источника света путем фототропизма собрать максимальное количество энергии. Точно так же, геотропизм делает растения растут в сторону центра тяжести. Фундаментальный механизм , приводящий к таким трофических реакций предполагает асимметричное образование градиентной фитогормонов ауксина 1. Акт формирования локального градиента ауксина хорошо характеризуется; гены, которые участвуют в этом механизме представляют собой дорожную карту для действия гормонов 2-8. Конкретное положение ауксина эффлюксных носителей, таких как PIN – сформированным (PIN) и Р-гликопротеины, выполняет движение ауксина из цитоплазмы в клеточной стенке клетки донора 9,10. Furthermore, активным Н + / IAA symport активности ауксина притока носителей, таких как AUX1 / LAX белков семейства, ауксина, наконец , доставлены в соседние ячейки 2,11,12 приемника. Это направленное движение ауксина известен как полярный ауксина транспорта (PAT). РАТ приводит к распределению дифференциальной ауксина на различных стадиях развития , и в ответ на различные стимулы , окружающую 13,14. Кроме того, нарушение в локализации или экспрессии любого из этих ауксина притока или оттока носителей приводит к сильному изменению в PAT, что приводит к нарушению градиента ауксина, что приводит к дефектам развития. В последнее время , Хан и др. сообщили , что регулирование plasmodesmal также необходимо для поддержания ауксина градиента 15. На сегодняшний день, более 30 plasmodesmal белки были идентифицированы 16. Среди этих белков, AtGSL8 было сообщено в качестве ключевого фермента синтеза каллозы в плазмодесмами (PD) и, следовательно, играет жизненно важную роль в MAINTAining предел PD размер исключения (SEL). Репрессированные выражение AtGSL8 привело к искажению рисунка ауксина градиента , приводящей к троповых без ответа , в отличие от дикого типа рассады 15.
В этой рукописи, методы, чтобы исследовать новые гены-кандидаты, которые участвуют в регуляции ПД предусмотрены. AtGSL8 был использован в качестве модели белка, чтобы проверить эти методы, поскольку это является ключевым ферментом способствует PD каллозы биосинтез. Благодаря питомничество летальности gsl8 нокаутных мутантов 17, дексаметазон (Dex) -inducible линии RNAi использовались в соответствии с ранее опубликованного доклада 15. Стратегия, представленная здесь, может быть адаптирована для скрининга генов, ответственных в ответ гипокотиля троповых контролируемой PD SEL.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой рукописи, стратегия скрининга мутант / сверхэкспрессии линии, которые неполноценный в фототропным и ГРАВИТРОПИЧЕСКУЮ ответов в связи с изменившейся PD каллозы и, следовательно, PD SEL подробно описан. PD синтез мозолистый и деградация в основном осуществляется путем каллозы синтазы…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано Национальным исследовательским фондом Кореи (NRF-2015R1A2A1A10053576), а также за счет гранта от Biogreen 21 программы Next-Generation (ГКПС, грант PJ01137901), Управление по развитию сельских районов, Республика Корея. РК, WS, ABB и DK были поддержаны Brain Korea 21 программы Plus (BK21 +).
Materials
| HPTS (8-Hydroxypyrene -1,3,6-trisulfonic acid trisodium salt) | Sigma | H1529-1G | Fluorescent dye as symplasmic tracer |
| LE Agarose | Dongin-Genomic | GEL001-500G | Used for HPTS agarose block |
| Microwave oven | LG-Goldstar | Machine for boiling agarose gel | |
| 100 mL glass conical flask | Dong Kwang | A0205 | Used to boil HPTS agarose gel |
| Petri Dish (35×10 mm) | SPL life sciences | SPL10035 | Used to make HPTS agarose blocks and wash plant samples |
| Microscope cover slides and glass slides (24 x 50 mm) | Marienfeld Laboratory Glassware | 101222 | Used for HPTS agarose blocks and microscopic sample preparation |
| MS medium plates 125 x 125 x 20 mm | SPL life sciences | SPL11125 | Plates to make MS agar medium |
| Scissors | Germany Stainless | HSB 942-11 | Used to excise hook region of plant samples |
| Murashige and Skoog (MS) basal salt mixture | Duchefa | P10453.01 | MS medium including vitamins. |
| (N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES) monohydrate | Bioshop | 3G30212 | To make MS media. |
| Plant agar | Duchefa | P1001.1000 | To solidify MS media. |
| Autoclave | ALP | CL-40L | |
| Shaker | Wise Mix | SHO-1D | To wash off the aniline blue staining buffer and HPTS dye in a placid way. |
| 1 ml Blue tips | Sorenson | 10040 | |
| 1 ml pipette | BioPette | L-1101-2 | |
| Surgical tape | MIcropore | 1530-0 | To seal the MS plate |
| Aniline blue (Methyl blue) | Sigma | M5528-25G | Used to prepare aniline blue staining buffer. |
| Glycine | Bioshop | GLN001 | Used to prepare aniline blue staining buffer. |
| DDG | Sigma | D8375-1G | Used for the inhibition of callose synthases. |
| Confocal microscope | Olympus | FV1000MPE SIM | To check aniline blue staining and HPTS dye loading result. |
| Stirrer | I lab | K400 | To mix media solution. |
| Aluminium foil | SW cooking foil | To wrap plates in a dark condition. | |
| Sodium hypochlorite | Samjin Industry | To surface-sterilized seeds |
References
- Went, F. W., Thimann, K. V., Bard, P. Phytohormones. Experimental biology monographs. , 204 (1937).
- Bennett, M. J., et al. Arabidopsis AUX1 gene: a permease-like regulator of root gravitropism. Science. 273 (5277), 948-950 (1996).
- Christensen, S. K., Dagenais, N., Chory, J., Weigel, D. Regulation of auxin response by the protein kinase PINOID. Cell. 100 (4), 469-478 (2000).
- Jurgens, G., Geldner, N. The high road and the low road: trafficking choices in plants. Cell. 130 (6), 977-979 (2007).
- Michniewicz, M., et al. Antagonistic regulation of PIN phosphorylation by PP2A and PINOID directs auxin flux. Cell. 130 (6), 1044-1056 (2007).
- Noh, B., Bandyopadhyay, A., Peer, W. A., Spalding, E. P., Murphy, A. S. Enhanced gravi- and phototropism in plant mdr mutants mislocalizing the auxin efflux protein PIN1. Nature. 423 (6943), 999-1002 (2003).
- Weijers, D., Friml, J. Snap Shot: auxin signaling and transport. Cell. 136 (6), 1172-1172 (2009).
- Wisniewska, J., et al. Polar PIN localization directs auxin flow in plants. Science. 312 (5775), 883 (2006).
- Murphy, A. S., Hoogner, K. R., Peer, W. A., Taiz, L. Identification, purification, and molecular cloning of N-1-naphthylphthalmic acid-binding plasma membrane-associated aminopeptidases from Arabidopsis. Plant Physiol. 128 (3), 935-950 (2002).
- Kleine-Vehn, J., Friml, J. Polar targeting and endocytic recycling in auxin-dependent plant development. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 24, 447-473 (2008).
- Yang, Y., Hammes, U. Z., Taylor, C. G., Schachtman, D. P., Nielsen, E. High-affinity auxin transport by the AUX1 influx carrier protein. Curr. Biol. 16 (11), 1123-1127 (2006).
- Geisler, M., Murphy, A. S. The ABC of auxin transport: the role of p-glycoproteins in plant development. FEBS Lett. 580 (4), 1094-1102 (2006).
- Band, L. R., et al. Root gravitropism is regulated by a transient lateral auxin gradient controlled by a tipping point mechanism. Proc. Natl. Acad. Sci.USA. 109 (12), 4668-4673 (2012).
- Vanneste, S., Friml, J. Auxin: a trigger for change in plant development. Cell. 136 (6), 1005-1016 (2009).
- Han, X., et al. Auxin-callose-mediated plasmodesmal gating is essential for tropic auxin gradient formation and signaling. Dev. Cell. 28 (2), 132-146 (2014).
- Kumar, R., Kumar, D., Hyun, T. K., Kim, J. Y. Players at plasmodesmal nano-channels. J. Plant Biol. 58, 75-86 (2015).
- Chen, X. Y., et al. The Arabidopsis callose synthase gene GSL8 is required for cytokinesis and cell patterning. Plant Physiol. 150, 105-113 (2009).
