Dit artikel beschrijft de methoden voor het screenen van de genen die plasmodesmal doorlaatbaarheid en dus auxine verloop tijdens trope respons. Dit omvat het meten van de mate van respons in tropische hypocotyl van Arabidopsis thaliana en controleren plasmodesmal permeabiliteit door 8-hydroxypyreen-1,3,6-trisulfonzuur (HPTS) laad- en tenslotte callose niveau assessment.
Het plantenhormoon auxine speelt een belangrijke rol in veel groei en ontwikkelingsprocessen, waaronder tropische reacties op licht en zwaartekracht. De oprichting van een auxine gradiënt is een belangrijke gebeurtenis die leidt tot phototropism en gravitropisme. Voorheen polaire auxine transport (PAT) bleek een auxine gradiënt vestigen in verschillende cellulaire domeinen van planten. Echter, Han et al. Onlangs aangetoond dat juiste auxine gradiënt vorming plasmodesmal-gemedieerde callose symplasmic verbinding tussen aangrenzende cellen is ook een kritische factor. In dit manuscript, de strategie om de rol van bepaalde genen, die phototropism en gravitropisme kan beïnvloeden door het veranderen van symplasmic verbinding via moduleren plasmodesmal callose synthese verheldering besproken. De eerste stap is om afwijkende tropische antwoorden van 3 dagen oude geëtioleerde zaailingen mutanten of overexpressie lijnen van een gen te screenen met het wildtype. Deze eerste screeningkan leiden tot de identificatie van een reeks genen functioneren in PAT of het regelen van symplasmic connectiviteit. Het tweede onderzoek betreft de sortering van kandidaten die veranderde tropische reacties door het beïnvloeden van symplasmic connectiviteit te tonen. Om dergelijke kandidaten pakken, de beweging van een symplasmic tracer en de afzetting van plasmodesmal callose onderzocht. Deze strategie zou nuttig zijn om nieuwe kandidaat-genen die symplasmic verbinding direct of indirect tijdens de tropische reacties en andere ontwikkelingsprocessen kunnen reguleren verkennen.
Planten, sessiele levende organismen hebben een zeer geavanceerde netwerk van cel-cel signalering naar diverse omgevingsstimuli aanpakken ontwikkeld. Trope reacties zijn een van de verschijnselen waarbij planten reageren op prikkels uit de omgeving. Planten vertonen twee belangrijke tropische reacties phototropism en gravitropisme. Fotosynthetische planten buigen in de richting van de lichtbron door phototropism om maximale energie te oogsten. Evenzo gravitropisme maakt de planten groeien naar het zwaartepunt. De fundamentele mechanisme dat leidt tot zulke tropische reacties impliceert asymmetrische gradiënt vorming van het plantenhormoon auxine 1. De handeling van de lokale auxine gradient formatie goed gekarakteriseerd; de genen die betrokken zijn bij dit mechanisme te voorzien van een routekaart voor hormoon actie 2-8. De specifieke positie van auxine efflux dragers, zoals PIN-GEVORMD (PIN) en P-glycoproteïnen, voert de beweging van auxine van het cytoplasma naar de celwand van donorcellen 9,10. Furthermore, door de actieve H + / IAA symport activiteit van auxine instroom dragers, zoals AUX1 / LAX familie eiwitten, auxine is eindelijk geleverd aan de naastgelegen ontvanger cellen 2,11,12. Deze gerichte beweging van auxine is bekend als polaire auxine transport (PAT). PAT leidt tot een differentiële auxine verdeling tijdens verschillende ontwikkelingsstadia en in reactie op verschillende omgevingsstimuli 13,14. Bovendien, de verstoring van lokalisatie of expressie van een van deze auxine influx of efflux dragers leidt tot ernstige verandering in PAT, waarbij een verstoring van de auxine gradiënt oorzaken, wat leidt tot defecten in de ontwikkeling. Onlangs, Han et al. gemeld dat plasmodesmal verordening Ook moet de auxine gradiënt 15 handhaven. Tot op heden zijn meer dan 30 plasmodesmal eiwitten geïdentificeerd 16. Van deze eiwitten is AtGSL8 gemeld als een sleutelenzym voor callose klanksynthese plasmodesmata (PD) en daardoor een belangrijke rol speelt in maintaining de PD uitsluiting op grootte limiet (SEL). Onderdrukte AtGSL8 expressie resulteerde in een vervormd auxine gradiëntpatroon leidt tot geen tropische reactie in tegenstelling tot wild type zaailingen 15.
In dit manuscript, methoden om nieuwe kandidaat-genen die betrokken zijn bij PD regelgeving zijn voorzien verkennen. AtGSL8 werd gebruikt als een modeleiwit deze methoden te testen, omdat het een sleutelenzym bijdraagt aan callose biosynthese PD. Door de zaailing-dodelijkheid van gsl8 knock-out mutanten 17 werden dexamethason (Dex) induceerbare RNAi lijnen gebruikt volgens een eerder gepubliceerd rapport 15. De strategie die hier kan worden aangepast aan genen die zijn betrokken bij hypocotyl tropische reactie gecontroleerd door PD SEL screenen.
In dit manuscript, een strategie voor mutant / overexpressie lijnen die defect in phototropic en gravitropic reacties zijn vanwege veranderde PD callose en derhalve PD SEL wordt beschreven screenen. PD callose synthese en afbraak wordt vooral bereikt door callose synthases en β-1,3-glucanasen, maar regulering van deze enzymen wordt door vele factoren upstream. Om te zoeken naar een dergelijke upstream factoren of kandidaten die rechtstreeks betrokken zijn bij PD regelgeving, hebben we het opzetten van deze methode voor…
The authors have nothing to disclose.
Dit onderzoek werd gesteund door de National Research Foundation Korea (NRF-2015R1A2A1A10053576), en door een subsidie van de Next-Generation BioGreen 21 Program (SSAC verlenen PJ01137901), plattelandsontwikkeling Administration, de Republiek Korea. RK, WS, ABB en DK werden ondersteund door Brain Korea 21 Plus-programma (BK21 +).
HPTS (8-Hydroxypyrene -1,3,6-trisulfonic acid trisodium salt) | Sigma | H1529-1G | Fluorescent dye as symplasmic tracer |
LE Agarose | Dongin-Genomic | GEL001-500G | Used for HPTS agarose block |
Microwave oven | LG-Goldstar | Machine for boiling agarose gel | |
100 mL glass conical flask | Dong Kwang | A0205 | Used to boil HPTS agarose gel |
Petri Dish (35×10 mm) | SPL life sciences | SPL10035 | Used to make HPTS agarose blocks and wash plant samples |
Microscope cover slides and glass slides (24 x 50 mm) | Marienfeld Laboratory Glassware | 101222 | Used for HPTS agarose blocks and microscopic sample preparation |
MS medium plates 125 x 125 x 20 mm | SPL life sciences | SPL11125 | Plates to make MS agar medium |
Scissors | Germany Stainless | HSB 942-11 | Used to excise hook region of plant samples |
Murashige and Skoog (MS) basal salt mixture | Duchefa | P10453.01 | MS medium including vitamins. |
(N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES) monohydrate | Bioshop | 3G30212 | To make MS media. |
Plant agar | Duchefa | P1001.1000 | To solidify MS media. |
Autoclave | ALP | CL-40L | |
Shaker | Wise Mix | SHO-1D | To wash off the aniline blue staining buffer and HPTS dye in a placid way. |
1 ml Blue tips | Sorenson | 10040 | |
1 ml pipette | BioPette | L-1101-2 | |
Surgical tape | MIcropore | 1530-0 | To seal the MS plate |
Aniline blue (Methyl blue) | Sigma | M5528-25G | Used to prepare aniline blue staining buffer. |
Glycine | Bioshop | GLN001 | Used to prepare aniline blue staining buffer. |
DDG | Sigma | D8375-1G | Used for the inhibition of callose synthases. |
Confocal microscope | Olympus | FV1000MPE SIM | To check aniline blue staining and HPTS dye loading result. |
Stirrer | I lab | K400 | To mix media solution. |
Aluminium foil | SW cooking foil | To wrap plates in a dark condition. | |
Sodium hypochlorite | Samjin Industry | To surface-sterilized seeds |