سريع المعالجة الأنزيمية من البروتينات للكشف عن مرض التصلب العصبي المتعدد مع Microreactor التدفق من خلال
Summary
A quick protocol for proteolytic digestion with an in-house built flow-through tryptic microreactor coupled to an electrospray ionization (ESI) mass spectrometer is presented. The fabrication of the microreactor, the experimental setup and the data acquisition process are described.
Abstract
الغالبية العظمى من قياس الطيف الكتلي (MS) القائم على أساليب تحليل البروتين وتشمل خطوة الهضم الأنزيمي قبل الكشف، وعادة مع التربسين. هذه الخطوة ضرورية لتوليد صغيرة الببتيدات الوزن الجزيئي، عموما مع MW <3،000-4،000 دا، التي تقع ضمن نطاق المسح الفعال للأجهزة قياس الطيف الكتلي. وتتضمن البروتوكولات التقليدية O / N الهضم الأنزيمي في 37 درجة مئوية. وقد أدت التطورات الحديثة في تطوير مجموعة متنوعة من الاستراتيجيات، وعادة ما تنطوي على استخدام microreactor مع الانزيمات يجمد أو مجموعة من العمليات الفيزيائية التكميلية التي تقلل من الوقت اللازم لهضم بروتين لبضع دقائق (على سبيل المثال، الميكروويف أو عالية الضغط). في هذا العمل، ونحن تصف مقاربة بسيطة وفعالة من حيث التكلفة التي يمكن تنفيذها في أي مختبر لتحقيق الهضم الأنزيمي سريع للبروتين. وكثف البروتين (أو خليط من البروتين) على المستعبدين C18-عكس المرحلة الأداء الإقتصادي الأداء العاليormance السائل اللوني (HPLC) جسيمات السيليكا مسبقة في العمود الشعري، وغرست التربسين في المخزن مائي على جزيئات لفترة قصيرة من الزمن. لتمكين على خط للكشف عن مرض التصلب العصبي المتعدد، ومزال الببتيدات زيتية مع نظام المذيبات مع زيادة المحتوى العضوي مباشرة في مصدر MS أيون. هذا النهج يتجنب استخدام جزيئات الإنزيم يجمد مرتفعة الثمن ولا تتطلب أي مساعدات لإتمام العملية. هضم البروتين وتحليل عينة الكامل يمكن تحقيقه في أقل من 3 دقائق ~ و ~ 30 دقيقة، على التوالي.
Introduction
وكثيرا ما حقق تحديد وتوصيف تنقية البروتينات باستخدام تقنيات MS. يتم هضم البروتين مع انزيم ويتم تحليل الببتيدات إلى أبعد من مرض التصلب العصبي المتعدد باستخدام ضخ الإعداد التجريبية بسيط. الهضم بروتين ضروري لتوليد شظايا الببتيد الصغيرة التي تقع في نطاق كتلة مفيد لمعظم تحليل MS، والتي يمكن أن تكون مجزأة بسهولة من خلال الطاقة المنخفضة تصادم التفكك المستحث لتوليد الأحماض الأمينية تسلسل المعلومات. للبروتينات معزولة أو خليط من البروتين بسيطة، ليست هناك حاجة أخرى لفصل الكروماتوغرافي من الببتيدات قبل الكشف عن مرض التصلب العصبي المتعدد. مزيج من 25-50 الببتيدات يمكن تحليلها بسهولة عن طريق غرس العينة مع ضخ حقنة مباشرة في مصدر MS أيون.
مطياف الكتلة يمكن أن تؤدي في التحليل والتأكد من تسلسل البروتين داخل زمنية قصيرة. مع وسائل الحصول على البيانات الحديثة، وهذه العملية يمكن أن يتحقق ثithin بضع دقائق أو حتى ثواني. العامل المحدد في استكمال العملية برمتها على المدى الزمني القصير هو الخطوة الهضم بروتين. عادة، وهذا يتم تنفيذه خلال بضع ساعات (أو O / N)، في الحل، في 37 درجة مئوية، وذلك باستخدام الركيزة: نسب انزيم (50-100): 1. لتقليل الوقت الهضم الأنزيمي لدقائق أو ثواني، microreactors انزيم يجمد، في شكل مفاعلات الموائع الدقيقة أو خراطيش المتاحة تجاريا، وقد وصفت 1-6 عادة، يتم يجمد الانزيم من قبل التساهمية، غير التساهمية / الامتزاز الفيزيائي، مجمع تشكيل أو التغليف، 3،6 في تعزيز الكفاءة العملية الأنزيمية التي مكنت من كبير أرض- حجم ونسب انزيم إلى الركيزة. وتشمل مزايا إضافية من المفاعلات يجمد تخفيض انحلال ذاتي والتدخل من الانزيم في تحليل MS، وتحسين الاستقرار انزيم وإعادة استخدام. وقد وصفت مجموعة متنوعة من النهج واستخدام الزجاج أو أجهزة microfabricated البوليمرية،باستخدام الإنزيمات ثبتوا على حبات مغناطيسية بواسطة تفاعلات الضد مستضد، 7،8 شرك في شبكات جسيمات متناهية الصغر من الذهب، 9 مغلفة في تيتانيا الألومينا سول المواد الهلامية 10 و nanozeolites، 11 أو من خلال القبض على ني NTA أو صاحب الوسم تشكيل تعقيدا. 6 بدلا من ذلك ، وقد وضعت الشعيرات الدموية مفتوح أنبوبي مع الإنزيمات ثبتوا، وكذلك 12 وعلاوة على ذلك، وقد تجلى تعزيز الانقسام بروتين باستخدام تسيطر الميكروويف إشعاع 13 أو بمساعدة ضغط أو الضغط تكنولوجيا الدراجات (PCT) للحد من أوقات رد الفعل إلى 30-120 دقيقة 14
على الرغم من المزايا المتعددة للمفاعلات انزيم يجمد، تكاليف خراطيش التجارية عالية، وتوافر الأجهزة ميكروفلويديك للاستخدام الروتيني محدودة، واستخدام نتائج تقنيات الميكروويف أو معاهدة التعاون بشأن البراءات في الحاجة إلى أجهزة إضافية. وكان الهدف من هذا العمل هو تطوير طريقة التي circumveNTS هذه العيوب، والتي يمكن تنفيذها بسهولة في كل مختبر لتمكين الباحثين مع نهج بسيط وفعال لأداء الانقسام الأنزيمية للبروتينات في التحضير لتحليل MS في غضون دقائق. يعتمد المنهج على استخدام مسعور، C18 الجسيمات التي هي محملة مسبقا في الشعيرات الدموية أو الجهاز ميكروفلويديك، وامتصاص البروتين (ق) من الفائدة على هذه الجسيمات تليها الهضم الأنزيمي خلال ضخ الانزيم على عمود معبأ والبروتين القبض على (ق). في هذا النهج، وثبتوا الركيزة من خلال التفاعلات غير التساهمية، وغرست الانزيم على البروتين وظائفها. وزيادة كفاءة بروتين الهضم من خلال المناطق سطح الجسيمات الكبيرة التي تعرض البروتين لمعالجة الأنزيمية، وخفض المسافات والأوقات نشر من وإلى السطح من الجزيئات، وتحسين نقل الجماعي، أي مرفق التساهمية التي قد تؤثر على نشاط الإنزيم، والقدرة بسرعة evaluatتركيبات (ه) من الإنزيمات المختلفة، disposability، ومضاعفة إذا تم تنفيذ هذه العملية في شكل ميكروفلويديك. ويتجلى هذا النهج مع استخدام خليط من البروتينات القياسية والتربسين- الأكثر شيوعا انزيم لبروتين الهضم قبل الكشف ESI-MS. كان مطياف الكتلة المستخدمة للكشف في هذه الدراسة فخ رباعي (LTQ) أداة الخطية.
Protocol
Representative Results
Discussion
وmicroreactor وصفها في هذا العمل يوفر سهلة لتنفيذ الإعداد التجريبية لأداء الهضم الأنزيمي من البروتينات لتمكين تحليل التصلب العصبي المتعدد وتحديد الهوية في أقل من 30 دقيقة. مزايا واضحة لهذا النظام، بالمقارنة مع الأساليب التقليدية، وتشمل البساطة والسرعة، وانخفاض استهلاك ك…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NSF/DBI-1255991 grant to IML.
Materials
| Ion trap ESI-MS | Thermo Electron | LTQ | The LTQ mass spectrometer is used for acquiring tandem MS data |
| XYZ stage | Newport | Multiple parts | The home-built XYZ stage is used to adapt the commercial LTQ nano-ESI source to receive input from various sample delivery systems |
| Stereo microscope | Edmund optics | G81-278 | The microscope is used to observe the microreactor packing process |
| Analytical balance/Metler | VWR | 46600-204 | The balance is used to weigh the protein samples |
| Ultrasonic bath/Branson | VWR | 33995-540 | The sonic bath is used for mixing/homogenizing the samples and dispersing the C18 particle slurry |
| Syringe pump 22 | Harvard Apparatus | 552222 | The micropump is used for loading, rinsing and eluting the sample and the enzyme on and from the packed capillary microreactor |
| Milli-Q ultrapure water system | EMD Millipore | ZD5311595 | The MilliQ water system is used to prepare purified DI water |
| Pipettor/Eppendorf (1000 µL) | VWR | 53513-410 | The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipettor/Eppendorf (100 µL) | VWR | 53513-406 | The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipettor/Eppendorf (10 µL) | VWR | 53513-402 | The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions |
| Fused silica capillary (100 µm ID x 360 µm OD) | Polymicro Technologies | TSP100375 | This capillary is used for the fabrication of the microreactor |
| Fused silica capillary (20 µm ID x 100 µm OD) | Polymicro Technologies | TSP020090 | This capillary is used for the fabrication of the ESI emitter |
| Fused silica capillary (50 µm ID x 360 µm OD) | Polymicro Technologies | TSP050375 | This capillary is used to transfer the samples and the eluent from the syringe pump to the capillary microreactor |
| Glass capillary cleaver | Supelco | 23740-U | This is a tool for cutting fused silica capillaries at the desired length |
| Glue | Eclectic Products | E6000 Craft | This glue is used for securing the ESI emitter into the capillary microreactor or the microfluidic chip |
| Epoxy glue | Epo-Tek | 353NDT | This glue is used to seal the microfluidic inlet hole through which the C18 particles are loaded |
| Reversed phase C18 particles (5 µm) | Agilent Technologies | Zorbax 300SB-C18 | These are C18 particles on which the proteins are adsorbed; the particles were extracted from a 4 mm x 20 cm C18 LC column from Agilent |
| Syringe/glass (250 µL) | Hamilton | 81130-1725RN | The glass syringes are used to load the C18 particle slurry in the capillary microreactor and to deliver the sample and eluents to the microreactor |
| Internal reducing PEEK Union (1/16” to 1/32”) | Valco | ZRU1.5FPK | This union is used to connect the 250 µL syringe to the microreactor for loading the 5 µm particle slurry |
| Stainless steel union (1/16”) | Valco | ZU1XC | The stainless steel union is used to connect the glass syringe needle to the infusion capillary |
| Microvolume PEEK Tee connector (1/32”) | Valco | MT.5XCPK | The Peek tee is used to connect the sample transfer capillary to the capillary microreactor; on its side arm, it enables the insertion of the Pt wire |
| Tee connector (light weight) | Valco | C-NTXFPK | This Tee connector is used to apply ESI voltage to the microfluidic chip through the sample transfer line |
| Pt wire (0.404 mm) | VWR | 66260-126 | The Pt wire provides electrical connection for ESI generation and is connected to the mass spectrometer ESI power supply |
| PTFE tubing (1/16” OD) | Valco | TTF115-10FT | The Teflon tubing is used to enable an air-tight connection between the syringe needle and the stainless steel union |
| PEEK tubing (0.015“ ID x 1/16” OD) | Upchurch Scientific | 1565 | The Peek tubing is used as a sleeve to enable an air-tight connection between the stainless steel union and the 50 µm ID transfer capillary |
| PEEK tubing (0.015” ID x 1/32” OD) | Valco | TPK.515-25 | The Peek tubing is used as a sleeve to enable a leak-free connection between the fused silica capillaries and the Peek Tee |
| Clean-cut polymer tubing cutter | Valco | JR-797 | This cutter is used to pre-cut the 1/16” and 1/32’ Peek polymer tubing that is used as sleeve for leak-free connections in pieces of ~4-5 cm in length |
| Amber vial (2 mL) | Agilent | HP-5183-2069 | The vials are used to prepare sample solutions and the C18 particle slurry |
| Amber vial (4 mL) | VWR | 66011-948 | The vials are used to prepare sample solutions |
| Polypropylene tube (15 mL) | Fisher | 12-565-286D | The vials are used to prepare buffer solutions |
| Cylinder (100 mL) | VWR | 24710-463 | The cylinder is used to measure volumes of solvent |
| Cylinder (10 mL) | VWR | 24710-441 | The cylinder is used to measure volumes of solvent |
| Pipette tips (1000 µL) | VWR | 83007-386 | The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipette tips (100 µL) | VWR | 53503-781 | The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipette tips (10 µL) | VWR | 53511-681 | The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions |
| Glass substrates | Nanofilm | B270 white crown, 3” x 3” | These are glass substrates for microchip fabrication |
| Male nut fitting (1/16”) | Upchurch | P203X | This fitting is used for connecting transfer capillaries to the microfluidic chip |
| Nanoport assembly | Upchurch | N-122H | This fitting is used for connecting transfer capillaries to the microfluidic chip |
| Reagents | |||
| Protein standards | Sigma | Multiple # | |
| Acetonitrile, HPLC grade | Fisher | A955 | |
| Methanol, HPLC grade | Fisher | A452 | |
| Isopropanol, HPLC grade | Sigma | 650447 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma | 302031 | |
| Ammonium bicarbonate | Aldrich | A6141 | |
| Trypsin, sequencing grade | Promega | V5111 |
References
- Petersen, D. H. Microfluidic Bioreactors. Encyclopedia of Microfluidics and Nanofluidics. , (2014).
- Matosevic, S., Szita, N., Baganz, F. Fundamentals and applications of immobilized microfluidic enzymatic reactors. J. Chem. Technol. Biotechnol. 86 (3), 325-334 (2011).
- Liu, Y., Liu, B., Yang, P., Girault, H. H. Microfluidic enzymatic reactors for proteome research. Anal. Bioanal. Chem. 390 (1), 227-229 (2008).
- Wu, H., Zhai, J., Tian, Y., Lu, H., Wang, X., Jia, W., Liu, B., Yang, P., Xu, Y., Wang, H. Microfluidic enzymatic-reactors for peptide mapping: strategy, characterization, and performance. LabChip. 4 (6), 588-597 (2004).
- Jin, L. J., Ferrance, J., Sanders, J. C., Landers, J. P. A microchip-based proteolytic digestion system driven by electroosmotic pumping. LabChip. 3 (1), 11-18 (2003).
- Asanomi, Y., Yamaguchi, H., Miyazaki, M., Maeda, H. Enzyme-immobilized microfluidic process reactors. Molecules. 7 (16), 6041-6059 (2011).
- Aravamudhan, S., Joseph, P. J., Kuklenyik, Z., Boyer, A. E., Barr, J. R. Integrated microfluidic enzyme reactor mass spectrometry platform for detection of anthrax lethal factor. , 1071-1074 (2009).
- Liu, X., Lo, R. C., Gomez, F. A. Fabrication of a microfluidic enzyme reactor utilizing magnetic beads. Electrophoresis. 30 (12), 2129-2133 (2009).
- Liu, Y., Xue, Y., Ji, J., Chen, X., Kong, J., Yang, P., Girault, H. H., Liu, B. Gold nanoparticle assembly microfluidic reactor for efficient on-line proteolysis. Mol. Cell. Proteomics. 6 (8), 1428-1436 (2007).
- Wu, H., Tian, Y., Liu, B., Lu, H., Wang, X., Zhai, J., Jin, H., Yang, P., Xu, Y., Wang, H. Titania and alumina sol-gel-derived microfluidics enzymatic-reactors for peptide mapping: design, characterization, and performance. J. Proteome Res. 3 (6), 1201-1209 (2004).
- Ji, J., Zhang, Y., Zhou, X., Kong, J., Tang, Y., Liu, B. Enhanced protein digestion through the confinement of nanozeolite-assembled microchip reactors. Anal. Chem. 80 (7), 2457-2463 (2008).
- Hustoft, H. K., Brandtzaeg, O. K., Rogeberg, M., Misaghian, D., Torsetnes, S. B., Greibrokk, T., Reubsaet, L., Wilson, S. R., Lundanes, E. Integrated enzyme reactor and high resolving chromatography in "sub-chip" dimensions for sensitive protein mass spectrometry. Scientific Reports. 3 (3511), 1-7 (2013).
- Pramanik, B. N., Mirza, U. A., Ing, Y. H., Liu, Y. H., Bartner, P. L., Weber, P. C., Bose, A. K. Microwave-enhanced enzyme reaction for protein mapping by mass spectrometry: A new approach to protein digestion in minutes. Protein Sci. 11 (11), 2676-2687 (2002).
- Olszowy, P. P., Burns, A., Ciborowski, P. S. Pressure-assisted sample preparation for proteomic analysis. Anal. Biochem. 438 (1), 67-72 (2013).
- Lord, G. A., Gordon, D. B., Myers, P., King, B. W. Tapers and restrictors for capillary electrochromatography and capillary electrochromatography-mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 768, 9-16 (1997).
- Lazar, I. M., Kabulski, J. L. Microfluidic LC Device with Orthogonal Sample Extraction for On-Chip MALDI-MS Detection. Lab Chip. 13 (11), 2055-2065 (2013).
- Harrison, D. J., Manz, A., Fan, Z. H., Ludi, H., Widmer, H. M. Capillary electrophoresis and sample injection systems on a planar glass chip. Anal. Chem. 64 (17), 1926-1932 (1992).
- Jacobson, S. C., Hergenroder, R., Koutny, L. B., Warmack, R. J., Ramsey, J. M. Effects of Injection Schemes and Column Geometry on the Performance of Microchip Electrophoresis Devices. Anal. Chem. 66 (7), 1107-1113 (1994).
- Armenta, J. M., Perez, M. J., Yang, X., Shapiro, D., Reed, D., Tuli, L., Finkielstein, C. V., Lazar, I. M. Fast Proteomic Protocol for Biomarker Fingerprinting in Cancerous Cells. J. Chromatogr. A. 1217, 2862-2870 (2010).
- Doucette, A., Craft, D., Li, L. Mass Spectrometric Study of the Effects of Hydrophobic Surface Chemistry and Morphology on the Digestion of Surface-Bound Proteins. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 14, 203-214 (2003).
- Lazar, I. M., Trisiripisal, P., Sarvaiya, H. A. Microfluidic Liquid Chromatography System for Proteomic Applications and Biomarker Screening. Anal. Chem. 78 (15), 5513-5524 (2006).
- Lazar, I. M., Karger, B. L. Multiple Open-Channel Electroosmotic Pumping System for Microfluidic Sample Handling,". Anal. Chem. 74 (24), 6259-6268 (2002).
- Lazar, I. M., Rockwood, A. L., Lee, E. D., Sin, J. C. H., Lee, M. L. High-speed TOFMS Detection for Capillary Electrophoresis. Anal. Chem. 71 (13), 2578-2581 (1999).
