Fast Processing Enzymatic des protéines pour MS de détection avec un microréacteur Flow-through
Summary
A quick protocol for proteolytic digestion with an in-house built flow-through tryptic microreactor coupled to an electrospray ionization (ESI) mass spectrometer is presented. The fabrication of the microreactor, the experimental setup and the data acquisition process are described.
Abstract
La grande majorité de la spectrométrie de masse (MS) à base de méthodes d'analyse de protéines impliquent une étape de digestion enzymatique avant la détection, généralement avec de la trypsine. Cette étape est nécessaire pour la génération de peptides de poids moléculaire, généralement PM <3000-4000 Da, qui se situent dans la plage de balayage effective de la spectrométrie de masse de l'instrumentation. protocoles classiques impliquent O / N digestion enzymatique à 37 ° C. Des progrès récents ont permis le développement d'une variété de stratégies, impliquant habituellement l'utilisation d'un microréacteur avec des enzymes immobilisées ou d'une série de processus physiques complémentaires qui permettent de réduire le temps nécessaire à la digestion protéolytique , à quelques minutes (par exemple, micro – onde ou de haute activité pression). Dans ce travail, nous décrivons une approche simple et rentable qui peut être mis en œuvre dans un laboratoire pour réaliser une digestion enzymatique rapide d'une protéine. Le (ou mélange de protéines) de la protéine est adsorbé sur C18 lié en phase inverse à haute perfORMANCE chromatographie liquide (HPLC) des particules de silice pré-chargés dans une colonne capillaire, et de la trypsine dans un tampon aqueux est imprégné sur les particules pendant un court laps de temps. Pour activer la détection en ligne MS, les peptides tryptiques sont élues avec un système solvant avec un contenu organique augmenté directement dans la source MS ion. Cette approche évite l'utilisation de particules d'enzymes immobilisées à prix élevé et ne nécessite pas d'aide pour compléter le processus. la digestion des protéines et analyse complète de l'échantillon peut être accompli en moins de 3 min et ~ ~ 30 min, respectivement.
Introduction
L'identification et la caractérisation des protéines purifiées sont fréquemment obtenus en utilisant des techniques de SM. La protéine est digérée par une enzyme et les peptides sont en outre analysés par SM en utilisant un dispositif expérimental de perfusion simple. la digestion protéolytique est nécessaire pour produire des petits fragments peptidiques qui se situent dans la plage de masse utile de la plupart des analyseurs de sclérose en plaques, et qui peut être facilement fragmenté par une faible énergie dissociation induite par collision pour générer des informations de séquence d'acides aminés. Pour les protéines isolées ou mélanges de protéines simples, il n'y a plus besoin d'une séparation chromatographique des peptides avant la détection MS. Un mélange de 25-50 peptides peut être facilement analysé en insufflant de l'échantillon avec une pompe à seringue directement dans la source d'ions SP.
Le spectromètre de masse peut effectuer l'analyse et confirmer la séquence d'une protéine dans un laps de temps court. Avec les méthodes d'acquisition de données modernes, ce processus peut être accompli wurant quelques minutes, voire quelques secondes. Le facteur limitant dans la réalisation de l'ensemble du processus sur une échelle de temps courte est l'étape de digestion protéolytique. En règle générale, ceci est réalisé en quelques heures (ou O / N), en solution, à 37 ° C, en utilisant un substrat: ratios de (50-100) de l'enzyme: 1. Pour réduire le temps de digestion enzymatique minutes ou secondes, microréacteurs d'enzymes immobilisées, sous la forme de réacteurs microfluidiques ou des cartouches disponibles dans le commerce, ont été décrits. 1-6 Typiquement, l'enzyme est immobilisée par liaison covalente, non covalente / adsorption physique, complexe la formation ou l' encapsulation, 3,6- l'efficacité accrue du processus enzymatique étant activé par la grande surface-volume et de rapports enzyme-substrat. Des avantages supplémentaires de réacteurs immobilisés comprennent autolyse et l'interférence réduite de l'enzyme dans l'analyse MS, une stabilité améliorée et la réutilisabilité enzyme. Une variété d'approches, en utilisant du verre ou des dispositifs micro-usinés polymères ont été décrits,en utilisant des enzymes immobilisées sur des perles magnétiques par des interactions anticorps-antigène, 7,8 piégées dans des réseaux de nanoparticules d' or, 9 encapsulées dans du dioxyde de titane-alumine sol-gels 10 et nanozeolites, 11 ou capturés par Ni-NTA ou His-Tag formation du complexe. 6 Alternativement , capillaires ouvert tubulaires avec des enzymes immobilisées ont été développés, aussi bien. 12 par ailleurs, le renforcement de clivage protéolytique a été démontrée en utilisant micro – ondes irradiation contrôlée 13 ou de la technologie de vélo assisté à la pression ou à la pression (PCT) pour réduire les temps de réaction à 30-120 min. 14
Malgré les multiples avantages de réacteurs enzymatiques immobilisés, les coûts des cartouches commerciales est élevé, la disponibilité des dispositifs microfluidiques pour une utilisation de routine est limitée, et l'utilisation des technologies de micro-ondes ou PCT résultats dans le besoin pour l'instrumentation supplémentaire. Le but de ce travail était de développer une méthode qui circumveNTS ces inconvénients, et qui peuvent être facilement mises en œuvre dans tous les laboratoires de permettre aux chercheurs avec une approche simple et efficace pour effectuer un clivage enzymatique de protéines en préparation pour l'analyse MS en quelques minutes. L'approche repose sur l'utilisation de C18 particules hydrophobes qui sont pré-chargés dans un tube capillaire ou d'un dispositif microfluidique, et l'adsorption de la protéine (s) d'intérêt sur ces particules, suivie par une digestion enzymatique pendant la perfusion de l'enzyme au cours de la lit garni et de protéines (s) capturé. Dans cette approche, le substrat est immobilisé par des interactions non covalentes, et l'enzyme est perfusé sur la protéine immobilisée. L'efficacité protéolytique de digestion est augmentée par les grandes surfaces des particules qui exposent la protéine pour le traitement enzymatique, des distances et des temps de diffusion vers et à partir de la surface de particules réduite, améliore le transfert de masse, aucune liaison covalente qui peut affecter l'activité de l'enzyme, l'aptitude rapidement évaluate combinaisons de différentes enzymes, et le multiplexage jetabilité si le procédé est exécuté dans un format microfluidique. Cette approche est démontrée par l'utilisation d'un mélange de protéines standards et trypsine l'enzyme la plus couramment utilisée pour la digestion protéolytique avant la détection ESI-MS. Le spectromètre de masse utilisé pour la détection dans cette étude était un instrument linéaire piège quadripolaire (LTQ).
Protocol
Representative Results
Discussion
Le microréacteur décrit dans ce travail fournit un outil facile à mettre en œuvre l'installation expérimentale pour effectuer la digestion enzymatique de protéines pour permettre l'analyse MS et l'identification en moins de 30 min. Les avantages distincts de ce système, par rapport aux approches conventionnelles, notamment la simplicité, la rapidité, la faible consommation de réactifs et de faibles coûts. En particulier, il n'y a pas besoin de billes de trypsine immobilisée coûteux et des ca…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NSF/DBI-1255991 grant to IML.
Materials
| Ion trap ESI-MS | Thermo Electron | LTQ | The LTQ mass spectrometer is used for acquiring tandem MS data |
| XYZ stage | Newport | Multiple parts | The home-built XYZ stage is used to adapt the commercial LTQ nano-ESI source to receive input from various sample delivery systems |
| Stereo microscope | Edmund optics | G81-278 | The microscope is used to observe the microreactor packing process |
| Analytical balance/Metler | VWR | 46600-204 | The balance is used to weigh the protein samples |
| Ultrasonic bath/Branson | VWR | 33995-540 | The sonic bath is used for mixing/homogenizing the samples and dispersing the C18 particle slurry |
| Syringe pump 22 | Harvard Apparatus | 552222 | The micropump is used for loading, rinsing and eluting the sample and the enzyme on and from the packed capillary microreactor |
| Milli-Q ultrapure water system | EMD Millipore | ZD5311595 | The MilliQ water system is used to prepare purified DI water |
| Pipettor/Eppendorf (1000 µL) | VWR | 53513-410 | The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipettor/Eppendorf (100 µL) | VWR | 53513-406 | The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipettor/Eppendorf (10 µL) | VWR | 53513-402 | The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions |
| Fused silica capillary (100 µm ID x 360 µm OD) | Polymicro Technologies | TSP100375 | This capillary is used for the fabrication of the microreactor |
| Fused silica capillary (20 µm ID x 100 µm OD) | Polymicro Technologies | TSP020090 | This capillary is used for the fabrication of the ESI emitter |
| Fused silica capillary (50 µm ID x 360 µm OD) | Polymicro Technologies | TSP050375 | This capillary is used to transfer the samples and the eluent from the syringe pump to the capillary microreactor |
| Glass capillary cleaver | Supelco | 23740-U | This is a tool for cutting fused silica capillaries at the desired length |
| Glue | Eclectic Products | E6000 Craft | This glue is used for securing the ESI emitter into the capillary microreactor or the microfluidic chip |
| Epoxy glue | Epo-Tek | 353NDT | This glue is used to seal the microfluidic inlet hole through which the C18 particles are loaded |
| Reversed phase C18 particles (5 µm) | Agilent Technologies | Zorbax 300SB-C18 | These are C18 particles on which the proteins are adsorbed; the particles were extracted from a 4 mm x 20 cm C18 LC column from Agilent |
| Syringe/glass (250 µL) | Hamilton | 81130-1725RN | The glass syringes are used to load the C18 particle slurry in the capillary microreactor and to deliver the sample and eluents to the microreactor |
| Internal reducing PEEK Union (1/16” to 1/32”) | Valco | ZRU1.5FPK | This union is used to connect the 250 µL syringe to the microreactor for loading the 5 µm particle slurry |
| Stainless steel union (1/16”) | Valco | ZU1XC | The stainless steel union is used to connect the glass syringe needle to the infusion capillary |
| Microvolume PEEK Tee connector (1/32”) | Valco | MT.5XCPK | The Peek tee is used to connect the sample transfer capillary to the capillary microreactor; on its side arm, it enables the insertion of the Pt wire |
| Tee connector (light weight) | Valco | C-NTXFPK | This Tee connector is used to apply ESI voltage to the microfluidic chip through the sample transfer line |
| Pt wire (0.404 mm) | VWR | 66260-126 | The Pt wire provides electrical connection for ESI generation and is connected to the mass spectrometer ESI power supply |
| PTFE tubing (1/16” OD) | Valco | TTF115-10FT | The Teflon tubing is used to enable an air-tight connection between the syringe needle and the stainless steel union |
| PEEK tubing (0.015“ ID x 1/16” OD) | Upchurch Scientific | 1565 | The Peek tubing is used as a sleeve to enable an air-tight connection between the stainless steel union and the 50 µm ID transfer capillary |
| PEEK tubing (0.015” ID x 1/32” OD) | Valco | TPK.515-25 | The Peek tubing is used as a sleeve to enable a leak-free connection between the fused silica capillaries and the Peek Tee |
| Clean-cut polymer tubing cutter | Valco | JR-797 | This cutter is used to pre-cut the 1/16” and 1/32’ Peek polymer tubing that is used as sleeve for leak-free connections in pieces of ~4-5 cm in length |
| Amber vial (2 mL) | Agilent | HP-5183-2069 | The vials are used to prepare sample solutions and the C18 particle slurry |
| Amber vial (4 mL) | VWR | 66011-948 | The vials are used to prepare sample solutions |
| Polypropylene tube (15 mL) | Fisher | 12-565-286D | The vials are used to prepare buffer solutions |
| Cylinder (100 mL) | VWR | 24710-463 | The cylinder is used to measure volumes of solvent |
| Cylinder (10 mL) | VWR | 24710-441 | The cylinder is used to measure volumes of solvent |
| Pipette tips (1000 µL) | VWR | 83007-386 | The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipette tips (100 µL) | VWR | 53503-781 | The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipette tips (10 µL) | VWR | 53511-681 | The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions |
| Glass substrates | Nanofilm | B270 white crown, 3” x 3” | These are glass substrates for microchip fabrication |
| Male nut fitting (1/16”) | Upchurch | P203X | This fitting is used for connecting transfer capillaries to the microfluidic chip |
| Nanoport assembly | Upchurch | N-122H | This fitting is used for connecting transfer capillaries to the microfluidic chip |
| Reagents | |||
| Protein standards | Sigma | Multiple # | |
| Acetonitrile, HPLC grade | Fisher | A955 | |
| Methanol, HPLC grade | Fisher | A452 | |
| Isopropanol, HPLC grade | Sigma | 650447 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma | 302031 | |
| Ammonium bicarbonate | Aldrich | A6141 | |
| Trypsin, sequencing grade | Promega | V5111 |
References
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