Snabb Enzymatisk bearbetning av proteiner för MS Detection med en genomströmningsmikroreaktor
Summary
A quick protocol for proteolytic digestion with an in-house built flow-through tryptic microreactor coupled to an electrospray ionization (ESI) mass spectrometer is presented. The fabrication of the microreactor, the experimental setup and the data acquisition process are described.
Abstract
Den stora majoriteten av masspektrometri (MS) -baserade proteinanalysmetoder involverar en enzymatisk digestion steg före detektering, typiskt med trypsin. Detta steg är nödvändigt för genereringen av små molekylvikt peptider, i allmänhet med molekylvikt <3000-4000 Da, som faller inom det effektiva avsökningsintervall av masspektrometri instrumentering. Konventionella protokoll involverar O / N enzymatisk uppslutning vid 37 ° C. Nya framsteg har lett till utvecklingen av en mängd olika strategier, i allmänhet innebär att användningen av en mikroreaktor med immobiliserade enzymer eller en rad kompletterande fysikaliska processer som reducerar den tid som krävs för proteolytisk digestion till några minuter (t.ex. mikrovågsugn eller hög- tryck). I detta arbete, beskriver vi en enkel och kostnadseffektiv metod som kan genomföras i alla laboratorier för att uppnå snabb enzymatisk nedbrytning av ett protein. Proteinet (eller proteinblandning) adsorberas på C18-bunden omvänd fas performance vätskekromatografi (HPLC) kiseldioxidpartiklar förladdade i en kapillärkolonn, och trypsin i vattenhaltig buffert infuseras över partiklarna under en kort tidsperiod. För att möjliggöra on-line MS-detektion, är de tryptiska peptiderna eluerades med ett lösningsmedelssystem med ökad organiskt innehåll direkt i MS-jonkälla. Denna metod undviker användningen av dyra immobiliserade enzympartiklarna och inte kräver något stöd för att slutföra processen. Proteinupptaget och fullständig analysprov kan åstadkommas på mindre än ~ 3 min och ~ 30 minuter, respektive.
Introduction
Identifiering och karakterisering av renade proteiner är ofta uppnås genom att använda MS-tekniker. Proteinet digereras med ett enzym och dess peptider analyseras vidare medelst MS genom användning av en enkel infusionsexperimentuppställning. Proteolytisk nedbrytning är nödvändig för att generera små peptidfragment som faller i den användbara massområdet av de flesta MS analysatorer och som lätt kan splittrad genom lågenergi kollision dissociation att generera aminosyrasekvensinformation. För isolerade proteiner eller enkla proteinblandningar, det finns ingen ytterligare behov av kromatografisk separation av peptider före MS-detektion. En blandning av 25-50 peptider kan lätt analyseras genom infusion av provet med en sprutpump direkt i MS-jonkälla.
Masspektrometern kan utföra analysen och bekräfta sekvensen av ett protein inom en kort tidsram. Med moderna datainsamlingsmetoder, kan denna process utföras wnom några minuter eller till och med sekunder. Den begränsande faktorn för att fullborda hela processen på en kort tidsskala är den proteolytiska digereringssteget. Typiskt utförs detta under några timmar (eller O / N), i lösning, vid 37 ° C, med användning av substrat: enzymförhållanden av (50-100): 1. För att minska den enzymatiska uppslutningstiden till minuter eller sekunder, immobiliserade enzymmikroreaktorer, i form av mikroflödesreaktorer eller kommersiellt tillgängliga patroner, har beskrivits. 1-6 Typiskt är det enzym som immobiliseras genom kovalent, icke-kovalent / fysikalisk adsorption, komplex bildning eller inkapsling, varvid 3,6 den förbättrade effektiviteten av den enzymatiska processen möjliggörs av den stora ytan-till-volym och enzym-till-substrat-förhållanden. Ytterligare fördelar med immobiliserade reaktorer innefattar minskad autolys och störningar från enzymet i MS-analys, förbättrad enzymstabilitet och återanvändbarhet. En mängd olika metoder, med hjälp av glas eller polymera mikrofabricerade anordningar har beskrivits,användning av enzymer immobiliserade på magnetiska pärlorna genom antikropp-antigeninteraktioner, 7,8 innesluten i guld nanopartiklar nätverk, 9 inkapslade i titandioxid-aluminiumoxidsol-geler 10 och nanozeolites, 11 eller fångas genom Ni-NTA eller His-Tag komplexbildning. 6 Alternativt öppen rörformiga kapillärer med immobiliserade enzymer har utvecklats, liksom. 12 Dessutom förbättrad proteolytisk klyvning har visats med hjälp av kontrollerad mikrovågsbestrålning 13 eller tryckassisterad eller tryckcykelteknik (PCT) för att minska reaktionstiderna till 30-120 min. 14
Trots de många fördelarna med immobiliserade enzymreaktorer, kostnaderna för kommersiella patroner är hög, är tillgången på mikroflödessystem enheter för rutinmässig användning begränsad och användningen av mikrovågor eller PCT teknik resulterar i behov av ytterligare instrumentering. Målet med detta arbete var att utveckla en metod som circumveNTS dessa nackdelar, och som enkelt kan implementeras i varje laboratorium för att ge forskare med en enkel och effektiv metod för att utföra enzymatisk klyvning av proteiner i förberedelse för MS-analys inom några minuter. Det tillvägagångssätt förlitar sig på användningen av hydrofoba, C18-partiklar som är förinstallerade i en kapillär eller mikrofluidikanordning, och adsorptionen av protein (er) av intresse på dessa partiklar följt av enzymatisk digerering under infusionen av enzymet över packad bädd och fångade protein (er). I detta tillvägagångssätt är substratet immobiliseras genom icke-kovalenta interaktioner, och enzymet infunderas över immobiliserat protein. Den proteolytiska digere effektivitet ökas av de stora partikel ytareor som exponerar proteinet för enzymatisk behandling, reducerat avstånd och diffusionstider till och från ytan hos partiklar, förbättrad massaöverföring, ingen kovalent vidfästning som kan påverka enzymets aktivitet, förmåga att snabbt evaluate kombinationer av olika enzymer, disposability och multiplexering om processen exekveras i en mikroflödesformat. Detta tillvägagångssätt demonstreras med användning av en blandning av standardproteiner och trypsin-den mest använda enzym för proteolytisk digerering före ESI-MS-detektion. Den masspektrometer som används för detektering i denna studie var en linjär fälla kvadrupol (LTQ) instrument.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mikroreaktorn som beskrivs i detta arbete ger ett enkelt att implementera experimentuppställning för utförande av enzymatisk nedbrytning av proteiner för att möjliggöra MS-analys och identifiering på mindre än 30 min. De distinkta fördelarna med detta system, i jämförelse med konventionella tillvägagångssätt, innefattar enkelhet, snabbhet, låg reagensförbrukning och låga kostnader. I synnerhet finns det inget behov av dyra immobiliserade trypsin pärlor och patroner. Framställningen av den kapillära m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NSF/DBI-1255991 grant to IML.
Materials
| Ion trap ESI-MS | Thermo Electron | LTQ | The LTQ mass spectrometer is used for acquiring tandem MS data |
| XYZ stage | Newport | Multiple parts | The home-built XYZ stage is used to adapt the commercial LTQ nano-ESI source to receive input from various sample delivery systems |
| Stereo microscope | Edmund optics | G81-278 | The microscope is used to observe the microreactor packing process |
| Analytical balance/Metler | VWR | 46600-204 | The balance is used to weigh the protein samples |
| Ultrasonic bath/Branson | VWR | 33995-540 | The sonic bath is used for mixing/homogenizing the samples and dispersing the C18 particle slurry |
| Syringe pump 22 | Harvard Apparatus | 552222 | The micropump is used for loading, rinsing and eluting the sample and the enzyme on and from the packed capillary microreactor |
| Milli-Q ultrapure water system | EMD Millipore | ZD5311595 | The MilliQ water system is used to prepare purified DI water |
| Pipettor/Eppendorf (1000 µL) | VWR | 53513-410 | The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipettor/Eppendorf (100 µL) | VWR | 53513-406 | The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipettor/Eppendorf (10 µL) | VWR | 53513-402 | The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions |
| Fused silica capillary (100 µm ID x 360 µm OD) | Polymicro Technologies | TSP100375 | This capillary is used for the fabrication of the microreactor |
| Fused silica capillary (20 µm ID x 100 µm OD) | Polymicro Technologies | TSP020090 | This capillary is used for the fabrication of the ESI emitter |
| Fused silica capillary (50 µm ID x 360 µm OD) | Polymicro Technologies | TSP050375 | This capillary is used to transfer the samples and the eluent from the syringe pump to the capillary microreactor |
| Glass capillary cleaver | Supelco | 23740-U | This is a tool for cutting fused silica capillaries at the desired length |
| Glue | Eclectic Products | E6000 Craft | This glue is used for securing the ESI emitter into the capillary microreactor or the microfluidic chip |
| Epoxy glue | Epo-Tek | 353NDT | This glue is used to seal the microfluidic inlet hole through which the C18 particles are loaded |
| Reversed phase C18 particles (5 µm) | Agilent Technologies | Zorbax 300SB-C18 | These are C18 particles on which the proteins are adsorbed; the particles were extracted from a 4 mm x 20 cm C18 LC column from Agilent |
| Syringe/glass (250 µL) | Hamilton | 81130-1725RN | The glass syringes are used to load the C18 particle slurry in the capillary microreactor and to deliver the sample and eluents to the microreactor |
| Internal reducing PEEK Union (1/16” to 1/32”) | Valco | ZRU1.5FPK | This union is used to connect the 250 µL syringe to the microreactor for loading the 5 µm particle slurry |
| Stainless steel union (1/16”) | Valco | ZU1XC | The stainless steel union is used to connect the glass syringe needle to the infusion capillary |
| Microvolume PEEK Tee connector (1/32”) | Valco | MT.5XCPK | The Peek tee is used to connect the sample transfer capillary to the capillary microreactor; on its side arm, it enables the insertion of the Pt wire |
| Tee connector (light weight) | Valco | C-NTXFPK | This Tee connector is used to apply ESI voltage to the microfluidic chip through the sample transfer line |
| Pt wire (0.404 mm) | VWR | 66260-126 | The Pt wire provides electrical connection for ESI generation and is connected to the mass spectrometer ESI power supply |
| PTFE tubing (1/16” OD) | Valco | TTF115-10FT | The Teflon tubing is used to enable an air-tight connection between the syringe needle and the stainless steel union |
| PEEK tubing (0.015“ ID x 1/16” OD) | Upchurch Scientific | 1565 | The Peek tubing is used as a sleeve to enable an air-tight connection between the stainless steel union and the 50 µm ID transfer capillary |
| PEEK tubing (0.015” ID x 1/32” OD) | Valco | TPK.515-25 | The Peek tubing is used as a sleeve to enable a leak-free connection between the fused silica capillaries and the Peek Tee |
| Clean-cut polymer tubing cutter | Valco | JR-797 | This cutter is used to pre-cut the 1/16” and 1/32’ Peek polymer tubing that is used as sleeve for leak-free connections in pieces of ~4-5 cm in length |
| Amber vial (2 mL) | Agilent | HP-5183-2069 | The vials are used to prepare sample solutions and the C18 particle slurry |
| Amber vial (4 mL) | VWR | 66011-948 | The vials are used to prepare sample solutions |
| Polypropylene tube (15 mL) | Fisher | 12-565-286D | The vials are used to prepare buffer solutions |
| Cylinder (100 mL) | VWR | 24710-463 | The cylinder is used to measure volumes of solvent |
| Cylinder (10 mL) | VWR | 24710-441 | The cylinder is used to measure volumes of solvent |
| Pipette tips (1000 µL) | VWR | 83007-386 | The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipette tips (100 µL) | VWR | 53503-781 | The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipette tips (10 µL) | VWR | 53511-681 | The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions |
| Glass substrates | Nanofilm | B270 white crown, 3” x 3” | These are glass substrates for microchip fabrication |
| Male nut fitting (1/16”) | Upchurch | P203X | This fitting is used for connecting transfer capillaries to the microfluidic chip |
| Nanoport assembly | Upchurch | N-122H | This fitting is used for connecting transfer capillaries to the microfluidic chip |
| Reagents | |||
| Protein standards | Sigma | Multiple # | |
| Acetonitrile, HPLC grade | Fisher | A955 | |
| Methanol, HPLC grade | Fisher | A452 | |
| Isopropanol, HPLC grade | Sigma | 650447 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma | 302031 | |
| Ammonium bicarbonate | Aldrich | A6141 | |
| Trypsin, sequencing grade | Promega | V5111 |
References
- Petersen, D. H. Microfluidic Bioreactors. Encyclopedia of Microfluidics and Nanofluidics. , (2014).
- Matosevic, S., Szita, N., Baganz, F. Fundamentals and applications of immobilized microfluidic enzymatic reactors. J. Chem. Technol. Biotechnol. 86 (3), 325-334 (2011).
- Liu, Y., Liu, B., Yang, P., Girault, H. H. Microfluidic enzymatic reactors for proteome research. Anal. Bioanal. Chem. 390 (1), 227-229 (2008).
- Wu, H., Zhai, J., Tian, Y., Lu, H., Wang, X., Jia, W., Liu, B., Yang, P., Xu, Y., Wang, H. Microfluidic enzymatic-reactors for peptide mapping: strategy, characterization, and performance. LabChip. 4 (6), 588-597 (2004).
- Jin, L. J., Ferrance, J., Sanders, J. C., Landers, J. P. A microchip-based proteolytic digestion system driven by electroosmotic pumping. LabChip. 3 (1), 11-18 (2003).
- Asanomi, Y., Yamaguchi, H., Miyazaki, M., Maeda, H. Enzyme-immobilized microfluidic process reactors. Molecules. 7 (16), 6041-6059 (2011).
- Aravamudhan, S., Joseph, P. J., Kuklenyik, Z., Boyer, A. E., Barr, J. R. Integrated microfluidic enzyme reactor mass spectrometry platform for detection of anthrax lethal factor. , 1071-1074 (2009).
- Liu, X., Lo, R. C., Gomez, F. A. Fabrication of a microfluidic enzyme reactor utilizing magnetic beads. Electrophoresis. 30 (12), 2129-2133 (2009).
- Liu, Y., Xue, Y., Ji, J., Chen, X., Kong, J., Yang, P., Girault, H. H., Liu, B. Gold nanoparticle assembly microfluidic reactor for efficient on-line proteolysis. Mol. Cell. Proteomics. 6 (8), 1428-1436 (2007).
- Wu, H., Tian, Y., Liu, B., Lu, H., Wang, X., Zhai, J., Jin, H., Yang, P., Xu, Y., Wang, H. Titania and alumina sol-gel-derived microfluidics enzymatic-reactors for peptide mapping: design, characterization, and performance. J. Proteome Res. 3 (6), 1201-1209 (2004).
- Ji, J., Zhang, Y., Zhou, X., Kong, J., Tang, Y., Liu, B. Enhanced protein digestion through the confinement of nanozeolite-assembled microchip reactors. Anal. Chem. 80 (7), 2457-2463 (2008).
- Hustoft, H. K., Brandtzaeg, O. K., Rogeberg, M., Misaghian, D., Torsetnes, S. B., Greibrokk, T., Reubsaet, L., Wilson, S. R., Lundanes, E. Integrated enzyme reactor and high resolving chromatography in "sub-chip" dimensions for sensitive protein mass spectrometry. Scientific Reports. 3 (3511), 1-7 (2013).
- Pramanik, B. N., Mirza, U. A., Ing, Y. H., Liu, Y. H., Bartner, P. L., Weber, P. C., Bose, A. K. Microwave-enhanced enzyme reaction for protein mapping by mass spectrometry: A new approach to protein digestion in minutes. Protein Sci. 11 (11), 2676-2687 (2002).
- Olszowy, P. P., Burns, A., Ciborowski, P. S. Pressure-assisted sample preparation for proteomic analysis. Anal. Biochem. 438 (1), 67-72 (2013).
- Lord, G. A., Gordon, D. B., Myers, P., King, B. W. Tapers and restrictors for capillary electrochromatography and capillary electrochromatography-mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 768, 9-16 (1997).
- Lazar, I. M., Kabulski, J. L. Microfluidic LC Device with Orthogonal Sample Extraction for On-Chip MALDI-MS Detection. Lab Chip. 13 (11), 2055-2065 (2013).
- Harrison, D. J., Manz, A., Fan, Z. H., Ludi, H., Widmer, H. M. Capillary electrophoresis and sample injection systems on a planar glass chip. Anal. Chem. 64 (17), 1926-1932 (1992).
- Jacobson, S. C., Hergenroder, R., Koutny, L. B., Warmack, R. J., Ramsey, J. M. Effects of Injection Schemes and Column Geometry on the Performance of Microchip Electrophoresis Devices. Anal. Chem. 66 (7), 1107-1113 (1994).
- Armenta, J. M., Perez, M. J., Yang, X., Shapiro, D., Reed, D., Tuli, L., Finkielstein, C. V., Lazar, I. M. Fast Proteomic Protocol for Biomarker Fingerprinting in Cancerous Cells. J. Chromatogr. A. 1217, 2862-2870 (2010).
- Doucette, A., Craft, D., Li, L. Mass Spectrometric Study of the Effects of Hydrophobic Surface Chemistry and Morphology on the Digestion of Surface-Bound Proteins. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 14, 203-214 (2003).
- Lazar, I. M., Trisiripisal, P., Sarvaiya, H. A. Microfluidic Liquid Chromatography System for Proteomic Applications and Biomarker Screening. Anal. Chem. 78 (15), 5513-5524 (2006).
- Lazar, I. M., Karger, B. L. Multiple Open-Channel Electroosmotic Pumping System for Microfluidic Sample Handling,". Anal. Chem. 74 (24), 6259-6268 (2002).
- Lazar, I. M., Rockwood, A. L., Lee, E. D., Sin, J. C. H., Lee, M. L. High-speed TOFMS Detection for Capillary Electrophoresis. Anal. Chem. 71 (13), 2578-2581 (1999).
